Research Article

Korean Journal of Plant Resources. 1 October 2024. 448-454
https://doi.org/10.7732/kjpr.2024.37.5.448

ABSTRACT


MAIN

  • 서 언

  • 재료 및 방법

  •   공시재료 및 추출 방법

  •   HPLC 분석

  •   반응표면분석 실험 계획

  • 결과 및 고찰

  •   Verbascoside 함량 분석

  •   Rutin 함량 분석

  •   미선나무 잎의 추출 조건 최적화

  • 적 요

서 언

미선나무(Abeliophyllum distichum Nakai.)는 물푸레나무과(Oleaceae)에 속하는 낙엽관목으로, 한반도 고유종이며 중부 지역에서 자생한다(You and Lee, 2005). 미선나무는 verbascoside, rutin, catechin, chlorogenic acid, coumaric acid 등의 성분을 함유하고 있다고 보고되어 있으며(Kim and Lee, 2015; Lee et al., 2020; Yamamoto et al., 1998), 항주름, 항염증, 항비만, 미백효과 등이 보고되어(Choi et al., 2017; Eom et al., 2020; Kim and Lee, 2015; Yoo et al., 2020) 의약 소재와 화장품, 건강기능식품 소재로서 잠재성을 가지고 있는 수종이다.

미선나무의 유용물질 중 verbascoside는 Verbascum속의 식물에서 주로 발견되는 이차 대사산물로(Alipieva et al., 2014) 항염 활성(Kim et al., 2009), 항바이러스 활성(Chathuranga et al., 2019) 등을 가지며, 미선나무의 verbascoside 함량은 줄기보다 잎에서 높다(Lee et al., 2020). 또한 rutin은 플라보노이드 성분으로 강력한 항산화능을 가지며 항염, 항산화 등의 생체활성 기능이 확인되어 일반의약품과 영양보조제 등에 많이 이용된다(Kim et al., 2023b).

미선나무의 자원화를 위해서는 이와 같은 유용 물질과 함께 이 물질들의 최적 추출 조건에 대한 구명이 필요하다(Jeong, 2020). Verbascoside의 최적 추출에 관한 연구는 Rehmannia속 식물의 뿌리를 대상으로(Fan et al., 2018), rutin의 최적 추출에 관한 연구는 Amaranthus paniculatus, Ruta graveolens 등을 대상으로 수행된 바 있으나(Kraujalis et al., 2015; Molnar et al., 2018) 미선나무에서는 이 두 물질의 최적 추출에 관련한 연구가 부족한 실정이다.

한편, 식물에서 특정 지표 물질의 최적 추출 조건은 매우 다양하기 때문에 이를 구명하기 위해 1회에 한가지 인자만을 실험하는 방법은 시간과 비용 측면에서 비효율적인 문제가 있다(Baharuddin et al., 2021). 이를 해결하기 위한 연구 방법의 하나로 반응표면분석법을 제안할 수 있다(Breig and Luti, 2021). 반응표면분석법은 독립변수에 대한 종속변수의 영향과 관계를 분석하여 최적조건을 예측하는데 사용되는 분석법으로(Park et al., 2011), 최소의 실험 횟수로 최대의 정보를 얻을 수 있고(Myers, 1971), 변수에 대한 실험데이터를 분석하여 유의한 요인 효과들을 최적화하고 물리적인 시간 절감과 요인별 상호작용도 관찰할 수 있기 때문에 실제적 최적조건을 구하는 데 유용하게 사용된다(Zhu et al., 2010). 이에 따라 식물의 자원화를 위한 수확물 전처리, 추출 최적화 등에도 유용하게 이용되고 있다(Kim et al., 2023a; Lim et al., 2024). 반응표면분석법에는 Factorial design, Box-Behnken design, Central composite design 등의 실험 설계 방법이 이용되며, 이 중 Box-Behnken design (BBD)은 예측 모델 제작에 필요한 실험의 수가 적어 경제적인 장점이 있어 산업 연구에 널리 사용된다(Breig and Luti, 2021).

이에 본 연구에서는 반응표면분석법을 이용하여 원료로 이용되고 있는 미선나무 잎의 자원화 지표성분인 verbascoside와 rutin의 최적 추출 조건을 구명하고자 하였으며, 이를 통해 자원화 이용 효율 증진에 대한 정보를 제공하고자 하였다.

재료 및 방법

공시재료 및 추출 방법

본 연구에서 사용된 시료는 2024년 6월에 충북 옥천군 이원면 윤정리 생산단지에서 재배 중인 미선나무 품종 ‘옥황1호’의 잎을 채취하여 사용하였다. 채취한 잎은 수세하여 이물질을 제거하고 48 시간 동안 40℃에서 열풍건조 후 분쇄하여 실험에 이용하였다. 건조된 미선나무 잎은 1:100 (w/v) 비율로 0, 50, 100% 에탄올에 25, 50, 75℃ 온도에서 6, 18, 30 시간 동안 침지, 추출한 후 4,000 rpm으로 20 분간 원심분리하여 상등액을 실험에 사용하였다.

HPLC 분석

미선나무 잎 추출물의 verbascoside와 rutin 함량을 측정하기 위해 미선나무 잎 추출물과 에탄올에 용해한 표준물질을 0.45 ㎛ PVDF syringe filter (HENKE-JECT, Tuttlingen, Germany)로 여과하여 분석에 사용하였다. Thermo Ultimate 3000 (Thermo scientific, MA, USA)과 Shim-pack VP-ODS C8 (250 × 4.6 ㎜, 5 ㎛, Shimadzu, Kyoto, Japan)을 이용하여 컬럼 온도 40℃, 유속은 1.0 mL/min, 시료 주입량은 10 μL로 하여 검출파장 320 ㎚에서 분석하였으며, 분석조건은 Table 1과 같다. 모든 용매는 사용 전 탈기 및 여과하였다. 시료의 검출시간(retention time, RT)을 표준물질의 스펙트럼과 비교하여 정성 평가를 수행하였으며, 미선나무 추출물의 피크 면적을 기준으로 표준물질의 검량선을 이용하여 정량 분석하였다.

Table 1.

Analytical conditions of HPLC for analysis of verbascoside and rutin.

Time (min) Gradient profile
Mobile phase Az (%) Mobile phase By (%)
0 90 10
35 50 50
40 5 95
45 5 95
45.1 90 10
48 90 10

zA: 0.1% formic acid in water.

yB: Acetonitrile.

반응표면분석 실험 계획

미선나무 잎의 verbascoside와 rutin 추출 조건을 최적화하기 위하여 실험계획법(Design of Experiments, DOE) 중 반응표면분석법을 이용하였다. Box-Behnken design (BBD)에 따라 3가지 독립변수(X1: 에탄올 농도, X2: 추출 시간, X3: 추출 온도)를 설정하였다. BBD에 따라 중심점 5개를 포함하는 총 17개 구간을 설정하고 랜덤화하여 실험을 수행하였으며, 종속변수로는 verbascoside와 rutin의 함량을 선정하였다(Table 2). BBD를 통해 얻어진 결과는 R program (Ver 4.2.2) ‘rsm’ package를 이용하여 회귀분석에 의한 모델식을 예측하였다. 예측값과 실험값의 유의적 차이를 검증하기 위해 One-Sample t-test로 분석하였다.

Table 2.

Experimental design and response of the dependent variables to extraction conditions.

Run order Independent variables Dependent variables
EtOH
concentration
(%, X1)
Extraction time
(h, X2)
Extraction
temperature
(℃, X3)
Verbascoside
(㎎/g)
Rutin
(㎎/g)
1 100 30 50 83.80 5.57
2 50 6 75 163.16 10.45
3 100 18 25 56.10 3.82
4 100 18 75 134.57 8.02
5 50 6 25 66.85 5.96
6 50 18 50 144.70 3.65
7 100 6 50 54.77 3.73
8 50 18 50 143.76 3.64
9 50 30 25 59.40 4.90
10 50 18 50 144.60 3.70
11 0 18 75 74.45 9.62
12 50 18 50 142.68 3.60
13 0 18 25 22.21 4.69
14 0 6 50 5.74 4.50
15 50 18 50 148.68 3.67
16 50 30 75 176.62 14.42
17 0 30 50 19.50 4.43

결과 및 고찰

Verbascoside 함량 분석

Box-Behnken design에 의해 17개 구간의 추출 조건을 설정하였고, 이에 따른 미선나무 잎 추출물의 verbascoside 함량에 대한 반응표면분석 결과는 Fig. 1과 같다. 세 가지 독립변수 중 에탄올 농도(X1)와 추출 시간(X2) 증가할수록 verbascoside 함량이 증가하다가 다시 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 추출 온도(X3)가 증가할수록 verbascoside 함량이 증가하는 양상을 확인할 수 있었다. 0%보다 높은 농도의 에탄올 용매를 이용한 추출 시 verbascoside 함량이 높은 양상은 식물을 이용한 추출 시 일반적으로 유기용매 추출이 열수 추출에 비해 이차 대사산물의 함량이 높다는 보고와 유사하였다(Kang et al., 2024). Verbascoside 함량에 대한 추출 조건의 영향은 Table 3과 같이 2차 회귀식으로 유도되었다. 독립변수 회귀방정식의 R2값이 0.978로 1에 가까운 값을 나타내어 반응모형을 신뢰할 수 있음을 확인하였다. 에탄올 농도(X1) 일차항과 이차항의 p-value가 0.001 이하로 가장 낮은 값을 보였다. ANOVA를 수행하였을 때, 교차항을 제외한 모든 항과 예측 모델의 F-value가 15 이상으로 높고, p-value가 0.01 이하로 낮은 결과 값을 보여 유의성이 있다고 판단되었다(Table 4). Lack of fit값은 0.01 이하로 낮았으나 적합결여 검정을 보완하는 방법으로 모형 적합비율(MFP, Model-Fit Propartion)과 순수오차 변동계수(CPEV, Coefficient of Pure Error Variation)를 사용할 수 있으며, 모형 적합비율은 최대 1의 값을 가지며, 값이 클수록, 최소 0의 값을 가지는 순수오차 변동계수는 값이 작을수록 모형이 적합함을 의미한다(Rheem and Rheem, 2012). Verbascoside 예측 모형의 모형 적합비율은 0.9785, 순수오차 변동계수는 3.13%로 모형이 적합함을 확인하였다.

https://cdn.apub.kr/journalsite/sites/kjpr/2024-037-05/N0820370502/images/kjpr_2024_375_448_F1.jpg
Fig. 1.

Response surface plot showing effects of extraction conditions on verbascoside (a, b, c) and rutin (d, e, f).

Table 3.

Optimalized response polynomial equations fitted in quadratic model for verbascoside and rutin.

Output variables 2nd order polynomial R2 Adjusted R2
Verbascoside
(㎎/g)
-77.680 + 3.114X1 + 6.726X2 + 0.945X3 + 0.006X1X2 +
0.005X1X3 + 0.017X2X3 – 0.030X12 – 0.206X22 + 0.002X32
0.978 0.950
Rutin
(㎎/g)
18.865 + 0.018X1 – 0.613X2 – 0.533X3 + 0.001X1X2
+ 0.004X2X3 + 0.011X22 + 0.006X32
0.973 0.938
Table 4.

Analysis of variance for verbascoside and rutin.

DF Sum sq Mean sq F-value p-value
Verbascoside Rutin Verbascoside Rutin Verbascoside Rutin Verbascoside Rutin
Model 9 48905.9 148.3 5434.0 16.5 34.78 27.77 < 0.01 < 0.01
Linear 3 20484.1 70.2 6828.0 23.4 43.7 39.5 < 0.01 < 0.01
Interaction 3 339.6 7.4 113.2 2.5 0.7 4.1 0.57 0.06
Square 3 28082.2 70.7 9360.7 23.6 59.9 39.7 < 0.01 < 0.01
Residuals 7 1093.8 4.2 156.3 0.6
Lack of fit 3 1073.1 4.1 357.7 1.4 69.3 1009.1 < 0.01 < 0.01
Pure error 4 20.6 < 0.01 5.2 < 0.01
Total 16 49999.7 152.4

Rutin 함량 분석

미선나무 잎의 rutin 함량에 대한 반응표면분석 결과는 Fig. 1과 같다. 에탄올 농도(X1)가 증가할수록 rutin 함량이 증가하다가 다시 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 추출 시간(X2)과 추출 온도(X3)가 증가할수록 rutin 함량이 감소하다가 다시 증가하는 것으로 예측되었다. Rutin 함량에 대한 추출 조건의 영향은 Table 3과 같이 2차 회귀식으로 유도되었다. 독립변수 회귀방정식의 R2값이 0.973으로 1에 가까운 값을 나타내어 반응모형을 신뢰할 수 있음을 확인하였다. 추출 온도(X3) 일차항과 이차항의 p-value가 0.001 이하의 값을 보여 rutin 함량 변화에 큰 영향을 미쳤다. 이는 rutin의 추출에서 추출 온도가 증가할수록 더 높은 확산 속도를 가져 추출 효율이 향상될 수 있다는 보고와 유사하였다(Kraujalis et al., 2015). ANOVA를 수행하였을 때, 교차항을 제외한 모든 항과 예측 모델의 F-value가 15 이상으로 높고, p-value가 0.01 이하로 낮은 결과값을 보여 유의성이 있다고 판단되었다(Table 4). Lack of fit값은 0.01 이하로 낮았으나 rutin 예측 모형의 모형 적합비율은 0.9730, 순수오차 변동계수는 1.94%로 모형이 적합함을 확인하였다.

미선나무 잎의 추출 조건 최적화

미선나무 잎에서 반응표면분석을 통하여 도출된 verbascoside와 rutin 최적 추출 조건은 Table 5와 같다. Verbascoside와 rutin 모두 정상점(stationary point)이 실험 조건 내에서 확인되지 않았으나 에탄올의 농도가 0~100%로 제한되고 끓는 점이 78℃인 것을 고려하였을 때, verbascoside의 최적 추출 조건은 에탄올 농도 60%, 추출 시간 14.4 시간, 추출 온도 75℃였다. 최적 추출 조건에서 예상된 verbascoside의 값은 193.92 ㎎/g이었으며, 실제 실험값은 193.66±4.37 ㎎/g으로 95% 신뢰구간에서 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 그러나 14.4 시간 이후 verbascoside의 함량이 감소하는 경향이 나타나기도 하였다. 이는 추출 시간이 길어짐에 따라 미선나무 잎 내 verbascoside의 분해에 의한 것으로 사료된다. Fan et al. (2018)도 지황 뿌리를 대상으로 초음파 추출 시 75℃에서 4 시간 이상이 지나면 verbascoside가 약 60% 정도 분해될 수 있다고 보고하였으며, 이는 추출 방법에 따라 고온에서 일정 시간 이상의 추출은 verbascoside의 함량을 감소시킬 수 있다는 것을 시사한다. 이에 따라 향후 높은 온도에서 추출 시간을 단축시켜 verbascoside의 수율을 높일 수 있는 추출방법에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Rutin의 최적 추출 조건은 에탄올 농도 52%, 추출 시간 30 h, 추출 온도 75℃였다. 최적 추출 조건에서 예상된 rutin의 함량은 13.67 ㎎/g이었으며, 실제 실험을 통해 얻은 값은 14.38±0.31 ㎎/g으로 더 높은 값을 보였다. 예측값과 실험값의 차이는 99.9% 신뢰구간에서 통계적으로 유의한 차이가 없어 예측값과 실험값의 유의성이 적었다. 메밀의 경우, Rutin 추출 최적 조건이 에탄올 농도 66%, 59.7℃로 예상되어(Shin et al., 2020) 본 연구 결과에 비해 높은 에탄올 농도와 낮은 추출 온도를 보였으나 이는 추출 방법에 따른 최적 조건의 차이로 사료된다. 본 연구에서는 반응표면분석법을 이용하여 미선나무 잎의 침지 추출 방법의 최적 추출 조건을 확인하였으며, 다양한 자원화 이용을 위해 전처리 조건과 추출 방법 등에 대한 추가적인 검증이 필요할 것으로 판단된다.

Table 5.

Predicted and experimental values using optimal conditions for verbascoside and rutin.

Extraction parameters Predicted values Experimental
values
EtOH conc.
(%)
Extracion time
(h)
Extracion temp.
(℃)
Verbascoside
(㎎/g)
60 14.4 75 193.92 193.66±4.37
Rutin
(㎎/g)
52 30 75 13.67 14.38±0.31

적 요

본 연구는 자원식물로 개발되고 있는 미선나무의 지표성분인 verbascoside와 rutin의 효율적인 확보를 위해 반응표면분석을 이용하여 최적 추출 조건을 확인하고자 수행되었다. 열풍건조된 미선나무 잎을 Box-Behnken design (BBD)에 따라 3가지 독립변수(에탄올 농도, 추출 시간, 추출 온도)를 설정하여 17개 구간에 대해 실험을 수행하였으며, 종속변수로는 verbascoside와 rutin의 함량을 측정하였다. Verbascoside의 최적 추출 조건은 에탄올 농도 60%, 추출 시간 14.4 h, 추출 온도 75℃였다. 최적 추출 조건에서 예상된 verbascoside의 값은 193.92 ㎎/g이었으며, 실험값은 193.66±4.37 ㎎/g이었다. Rutin의 최적 추출 조건은 에탄올 농도 52%, 추출 시간 30 h, 추출 온도 75℃였다. 최적 추출 조건에서 예상된 rutin의 함량은 13.67 ㎎/g이었으며, 실제 실험을 통해 얻은 값은 14.38±0.31 ㎎/g이었다. 반응표면분석법으로 도출된 최적 추출 조건을 통해 verbascoside와 rutin의 효율적인 확보가 가능함을 확인하였다.

Acknowledgements

본 연구는 산림청 연구개발 사업(과제번호: RS-2024-00404094)의 지원에 의해 이루어진 결과로 이에 감사드립니다.

Conflicts of Interest

The authors declare that they have no conflict of interest.

References

1

Alipieva, K.I., I.E. Orhan, I.I.T. Cankaya, E.P. Kostadinova and M.I. Georgiev. 2014. Treasure from garden: chemical profiling, pharmacology and biotechnology of mulleins. Phytochemistry 13:417-444.

10.1007/s11101-014-9361-5
2

Baharuddin, N.S, M.A.M. Roslan, M.A.M. Bawzer, A.M. Azzeme, Z.A. Rahman, M.E. Khayat, N.A.A. Rahman and Z.M. Sobri. 2021. Response surface optimization of extraction conditions and in vitro antioxidant and antidiabetic evaluation of an under-valued medicinal weed. Mimosa pudica. Plants 10(8):1692.

10.3390/plants10081692
3

Breig, S.J.M and K.J.K. Luti. 2021. Response surface methodology: A review on its applications and challenges in microbial cultures. Mater. Today: Proc. 42(5):2277-2284.

10.1016/j.matpr.2020.12.316
4

Chathuranga, K., M.S. Kim, H.C. Lee, T.H. Kim, J.H. Kim, W.A. Gayan Chathuranga, P. Ekanayaka, H. Wijerathne, W.K. Cho, H.I. Kim, J.H. Ma and J.S. Lee. 2019. Anti-respiratory syncytial virus activity of Plantago asiatica and Clerodendrum trichotomum extracts in vitro and in vivo. Viruses 11(7):604.

10.3390/v11070604
5

Choi, J.H., E.J. Seo, J. Sung, K.M. Choi, H. Kim, J.S. Kim, J. Lee, T. Efferth and T.K. Hyun. 2017. Polyphenolic compounds, antioxidant and anti-inflammatory effects of Abeliophyllum distichum Nakai extract. J. Appl. Bot. Food Qual. 90:266-273.

6

Eom, J., S.S. Thomas, N.Y. Sung, D.S. Kim, Y.S. Cha and K.A. Kim. 2020. Abeliophyllum distichum ameliorates high-fat diet-induced obesity in C57BL/6J mice by upregulating the AMPK pathway. Nutrients 12(11):3320.

10.3390/nu12113320
7

Fan, Y., C. Xu, J. Li, L. Zhang, L. Yang, Z. Zhou, Y. Zhu and D. Zhao. 2018. Ionic liquid-based microwave-assisted extraction of verbascoside from Rehmannia root. Ind. Crops. Prod. 124(15):59-65.

10.1016/j.indcrop.2018.07.063
8

Jeong, J.Y. 2020. Analysis of inorganic elements and indicator compound from Abeliophyllum distichum Nakai leaves. Department of Food and Nutrition, Master's Thesis, Chosun Univ., Korea (in Korean).

9

Kang, J., Y.W. Park, E.S. Jung and D. Choi. 2024. Polyphenol profiling and comparison of extraction solvents on useful component content and antioxidant activity of Rhododendron micranthum Shoot. Korean J. Plant Res. 37(2):110-119 (in Korean).

10

Kim, J.S., H.W. Jang, Y.S. Cho and H.Y. Kim. 2023a. Optimization of drying conditions for chamchwi (Aster scaber Thunb.) using the response surface methodology with a central composition design. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 52(8):844-855 (in Korean).

10.3746/jkfn.2023.52.8.844
11

Kim, S.J., H.B. Sohn, A.H. Park, J.N. Lee, S.H. Park, J.H. Nam, D.Y. Kim, D.C. Chang and Y.H. Kim. 2023b. Evaluation of the effects of hangover-releasing agent containing vinegar extract in common buckwheat and tartary buckwheat on alcohol metabolism and hangover improvement. Korean J. Plant Res. 36(5):435-445 (in Korean).

12

Kim, K.H., S. Kim, M.Y. Jung, I.H. Ham and W.K. Whang. 2009. Anti-inflammatory phenylpropanoid glycosides from Clerodendron trichotomum leaves. Arch. Pharm. Res. 32:7-13.

10.1007/s12272-009-1112-6
13

Kim, N.Y and H.Y. Lee. 2015. Enhancement of anti-wrinkle activities of Abeliophyllum distichum Nakai through low temperature extraction process. Korean J. Med. Crop Sci. 23(3):231-236 (in Korean).

10.7783/KJMCS.2015.23.3.231
14

Kraujalis, P., P.R. Venskutonis, E. Ibáñez and M. Herrero. 2015. Optimization of rutin isolation from Amaranthus paniculatus leaves by high pressure extraction and fractionation techniques. J. Supercrit. Fluids 104:234-242.

10.1016/j.supflu.2015.06.022
15

Lee, H.D., J.H. Kim, Q.Q. Pang, Q., P.M. Jung, E.J. Cho and S. Lee. 2020. Antioxidant activity and acteoside analysis of Abeliophyllum distichum. Antioxidants 9(11):1148.

10.3390/antiox9111148
16

Lim, W.S., S.Y. Ha, J.Y. Jung, H.C. Kim and J.K. Yang. 2024. Optimization of DPPH radical scavenging activity by response surface methodology in the ultrasonic-assisted extraction of Lespedeza bicolor Turcz. J. Agri. Life Sci. 58(2):65-80.

10.14397/jals.2024.58.2.65
17

Molnar, M., M. Jakovljević and S. Jokić. 2018. Optimization of the process conditions for the extraction of rutin from Ruta graveolens L. by choline chloride based deep eutectic solvents. Solv. Extr. Res. Dev. Jpn. 25(2):109-116.

10.15261/serdj.25.109
18

Myers, R.H. 1971. Response Surface Methodology. Allyn and Bacon, Inc., Boston, MA (USA). pp. 126-256.

19

Park, S.J., S.W. Moon, J. Lee, E.J. Kim and B.S. Kang. 2011. Optimization of roasting conditions for coffee beans by response surface methodology. Korean J. Food Preserv. 18:178-183 (in Korean).

10.11002/kjfp.2011.18.2.178
20

Rheem, S.S. and I.S. Rheem. 2012. The model-fit proportion and the coefficient of pure error variation, the measures to supplement the lack-of-fit test in response surface analysis. J. Korean Data Anal. Soc. 14(6):2989-2994 (in Korean).

21

Shin, J., I. Choi, J. Hwang, J. Yang, Y. Lee, S.I. Kim, E. Cha and J.Y. Yang. 2020. Optimization of the conditions of flavonoid extraction from tartary buckwheat sprout using response surface methodology. J. Life Sci. 30(12):1101-1108 (in Korean).

22

Yamamoto, H., K. Yoshida,, Y. Kondo and K. Inoue. 1998. Production of cornoside in Abeliophyllum distichum cell suspension cultures. Phytochemistry 48(2):273-277.

10.1016/S0031-9422(97)01134-5
23

Yoo, T.K., J.S. Kim and T.K. Hyun. 2020. Polyphenolic composition and anti-melanoma activity of white forsythia (Abeliophyllum distichum Nakai) organ extracts. Plants 9(6):757.

10.3390/plants9060757
24

You, J.H. and C.H. Lee. 2005. Analysis on herbaceous communities and flora around Abeliophyllum distichum habitats. Korean J. Plant Res. 18(2):315-324 (in Korean).

25

Zhu, T., H.J. Heo and K.H. Row. 2010. Optimization of crude polysaccharides extraction from Hizikia fusiformis using response surface methodology. Carbohydr Polym. 82:106-110.

10.1016/j.carbpol.2010.04.029
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