서 언
재료 및 방법
실험재료 및 시료 제조
세포배양
세포생존율 측정
NO 및 PGE2 생성량 측정
SDS-PAGE 및 Western blot 분석
mRNA 발현 분석
통계분석
결 과
AN-EA의 RAW264.7 세포에서 LPS 매개 NO 및 PGE2생성 억제 효과
AN-EA의 LPS 매개 iNOS 및 COX-2 단백질 및 mRNA 발현 억제 효과
AN-EA의 LPS 매개 MAPK/ATF-2와 NF-κB 신호전달 활성화 억제 효과
AN-EA의 RAW264.7 세포에서 Nrf2/HO-1 신호전달 활성화 효과
AN-EA 매개 Nrf2/HO-1 활성화에 대한 PI3K 신호전달 의존성
고 찰
적 요
서 언
염증반응은 병원체, 조직손상 및 독성자극에 대응하기 위한 필수적인 생체방어기전이지만 조절되지 않은 과도한 염증반응은 관절염, 죽상동맥경화, 염증성 장질환, 천식, 신경염증성 질환 및 암과 같은 다양한 만성질환의 병태생리에 관여한다(Medzhitov, 2008; Nathan and Ding, 2010). 대식세포는 선천면역계에서 중심적인 역할을 담당하는 세포로서 외부 자극을 인식한 후 nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) 등 다양한 염증 매개물질을 생성하여 염증반응의 개시와 증폭에 관여한다(Fujiwara and Kobayashi, 2005; MacMicking et al., 1997). RAW264.7 세포는 마우스 유래 대식세포성 세포주로, 산화스트레스, 염증반응 및 항염증 후보물질의 작용기전 평가에 널리 사용되는 in vitro 모델이다.
Lipopolysaccharide (LPS)는 그람음성균 외막의 주요 구성성분으로 대식세포에서 Toll-like receptor 4 (TLR4)를 통해 염증성 신호전달을 활성화하는 대표적 자극물질이다(Lu et al., 2008; Takeda and Akira, 2004). LPS에 의해 활성화된 대식세포에서는 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 발현이 증가하고, iNOS는 L-arginine으로부터 NO 생성을 촉진한다(MacMicking et al., 1997; Moncada et al., 1991). NO는 정상적인 면역방어에서는 병원체 제거와 세포 신호전달에 관여하지만 지속적으로 과생성될 경우 산화적 조직손상과 염증성 질환의 진행에 기여할 수 있다(MacMicking et al., 1997; Moncada et al., 1991). 또한 LPS는 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현을 유도하고, COX-2는 arachidonic acid로부터 PGE2를 포함한 prostaglandin 생합성을 촉진한다(Ricciotti and FitzGerald, 2011; Vane and Botting, 1987). PGE2는 혈관확장, 통증, 발열 및 염증세포 활성화와 관련된 주요 지질성 염증 매개물질이므로, iNOS/NO 및 COX-2/PGE2 축은 항염증 소재의 효능을 평가하는 핵심 지표로 활용된다(Ricciotti and FitzGerald, 2011; Vane and Botting, 1987).
LPS에 의해 유도되는 iNOS 및 COX-2 발현은 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)와 nuclear factor-κB (NF-κB)의 활성화에 의해 밀접하게 조절된다(Arthur and Ley, 2013; Guha and Mackman, 2001). MAPK family는 extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), p38 MAPK 및 c-Jun N-terminal kinase (JNK)로 구성되며, 이들은 염증성 자극에 반응하여 인산화된 후 다양한 전사인자를 활성화한다(Arthur and Ley, 2013; Kyriakis and Avruch, 2012). 특히 p38 및 JNK는 염증성 사이토카인과 iNOS, COX-2 발현 조절에 중요한 역할을 하며, ERK1/2 역시 세포 활성화 및 염증 매개물질 생성에 관여한다(Arthur and Ley, 2013; Kaminska, 2005). Activating transcription factor-2 (ATF-2)는 MAPK 하위에서 조절되는 전사인자로서 염증성 유전자 발현 조절에 관여할 수 있다(Kim et al., 2018; Reimold et al., 2001). 선행 연구에서도 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 MAPK/ATF-2와 NF-κB 신호 억제가 천연물의 항염증 기전으로 제시된 바 있다(Kim et al., 2018).
NF-κB는 염증반응에서 가장 중요한 전사조절인자 중 하나이며, p65/p50 heterodimer 형태로 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 염증 관련 유전자의 전사를 조절한다(Lawrence, 2009; Li and Verma, 2002). 정상상태에서 NF-κB는 inhibitor of κB (IκB)와 결합하여 세포질에 머물지만 LPS 자극에 의해 IκB kinase complex가 활성화되면 IκB가 인산화 및 분해되고 NF-κB p65가 핵으로 이동하여 염증성 유전자 발현을 유도한다(Hayden and Ghosh, 2012; Li and Verma, 2002). 따라서 MAPK 및 NF-κB 신호전달의 억제는 LPS로 유도된 대식세포 염증반응을 조절하는 중요한 전략으로 간주된다(Arthur and Ley, 2013; Kaminska, 2005; Lawrence, 2009).
한편 nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)는 산화스트레스 및 염증성 스트레스에 대응하는 대표적인 세포보호 전사인자이다(Itoh et al., 1999; Kobayashi and Yamamoto, 2005). 정상상태에서 Nrf2는 Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)에 의해 세포질에서 분해되지만 산화환원 상태 변화나 electrophilic stress에 의해 Keap1-Nrf2 결합이 약화되면 Nrf2가 안정화되어 핵으로 이동한다(Itoh et al., 1999; Kensler et al., 2007). 핵 내 Nrf2는 antioxidant response element (ARE)에 결합하여 heme oxygenase-1 (HO-1), NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1), glutamate-cysteine ligase 등 항산화 및 세포보호 유전자의 발현을 유도한다(Alam et al., 1999; Kensler et al., 2007). 특히 HO-1은 heme을 biliverdin, carbon monoxide 및 free iron으로 분해하는 효소로서 항산화, 항염증 및 세포보호 효과와 밀접하게 관련된다(Paine et al., 2010; Ryter and Choi, 2016). RAW264.7 세포에서 Nrf2/HO-1 경로의 활성화는 LPS로 유도되는 iNOS/NO 및 COX-2/PGE2 생성을 억제하는 중요한 항염증 기전으로 보고되어 있다(Park et al., 2013; Yao et al., 2019; Xu et al., 2015).
Phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt 신호는 Nrf2 활성화와 HO-1 발현 유도에 관여하는 상위 조절경로 중 하나이다(Xu et al., 2015). Punicalagin은 RAW264.7 세포에서 PI3K/Akt 신호를 통해 Nrf2/HO-1 발현을 유도하고 LPS 매개 산화스트레스를 억제하는 것으로 보고되었다(Xu et al., 2015). 또한 최근 버섯 유래 항염증 연구에서도 ROS/PI3K/Nrf2/HO-1 경로가 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 항염증 효과에 관여할 수 있음이 제시되었다(Choi et al., 2025). 따라서 MAPK/NF-κB 억제와 PI3K/Nrf2/HO-1 활성화를 동시에 분석하는 것은 천연물 유래 항염증 소재의 작용기전을 체계적으로 규명하는 데 중요하다(Choi et al., 2025; Park et al., 2013; Xu et al., 2015).
털목이버섯(Auricularia nigricans)은 식용 젤리버섯으로 목이속(Auricularia) 버섯은 일반적으로 목재에서 생육하는 부생성 균류이며, 자실체가 귀 모양 또는 반원형의 젤라틴성 조직을 나타내는 특징을 가진다. 이 속의 버섯은 동아시아를 비롯한 여러 지역에서 식용 및 약용 소재로 이용되어 왔으며, 다당류, 페놀성 화합물, 지방산, 스테롤류 등 다양한 생리활성 성분을 함유하는 것으로 보고되어 기능성 식품 및 천연물 의약소재로서 관심을 받고 있다. 특히 Auricularia nigricans ethyl acetate 분획에서는 linoleic acid ethyl ester, 9,12-octadecadienoic acid, ergosta-5,7,22-trien-3-ol 및 ellagic acid 유도체 등이 검출되었으며, 항산화, 항지방간 및 항염증 활성을 나타내는 것으로 보고되었다(Teoh et al., 2021). 이러한 선행연구는 털목이버섯이 염증성 매개인자 및 관련 신호전달 경로를 조절할 수 있는 생리활성 소재임을 시사하지만 현재까지 Auricularia nigricans의 항염증 효능과 작용기전에 대한 연구는 제한적이므로, 염증 반응 조절 효과와 그 분자적 기전을 규명하는 연구가 필요하다.
따라서 본 연구에서는 RAW264.7 대식세포에서 AN-EA가 LPS로 유도되는 NO, PGE2, iNOS 및 COX-2 생성에 미치는 억제활성을 평가하고, 그 작용기전으로 MAPK/ATF-2, NF-κB p65 및 ROS/PI3K/Nrf2/HO-1 신호전달계의 관여 여부를 확인하고자 하였다.
재료 및 방법
실험재료 및 시료 제조
본 연구에 사용한 털목이버섯(Auricularia nigricans)은 국립산림과학원 산림생명자원연구부에서 제공받았다. 확보한 시료는 이물질을 제거한 뒤 건조하고 분쇄하여 추출에 사용하였다. 건조 분말 20 g에 70% ethanol 1 L를 가하여 초음파 추출기(KODO Co., Ltd., Korea)를 이용하여 1시간씩 총 3회 초음파 추출을 수행하였다. 추출액은 여과 후 감압농축하여 조추출물을 제조하였다. 조추출물은 증류수에 현탁한 후 n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, 및 water 순으로 순차 분획하였다. 이 중 ethyl acetate 분획물을 감압농축 및 동결건조하여 Auricularia nigricans ethyl acetate fraction (AN-EA)으로 명명하였다. AN-EA는 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 stock solution으로 제조하였으며, 세포 처리 시 최종 DMSO 농도는 0.01% 이하가 되도록 조정하였다.
세포배양
RAW264.7 murine macrophage 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, USA)에서 구입하여 사용하였다. RAW264.7 세포는 마우스 유래 대식세포성 세포주로서 염증 및 산화스트레스 연구에 널리 사용되는 모델이다. 세포는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin 및 100 ㎍/mL streptomycin을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포는 70~80% confluence에 도달했을 때 계대배양하였으며, 모든 실험에는 대수증식기의 세포를 사용하였다.
세포생존율 측정
AN-EA가 RAW264.7 세포의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. RAW264.7 세포를 96-well plate에 5 × 104 cells/well의 농도로 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 안정화하였다. 이후 세포에 AN-EA를 50, 100 및 200 ㎍/mL 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 각 well에 MTT 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)을 최종농도 0.5 ㎎/mL가 되도록 첨가한 뒤 37℃에서 4시간 동안 추가 반응시켰다. 반응이 완료된 후 배지를 제거하고, 생성된 formazan crystal을 용해하기 위해 각 well에 DMSO 100 μL를 첨가하였다. Plate를 실온에서 충분히 진탕하여 formazan을 완전히 용해한 다음, microplate reader를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
NO 및 PGE2 생성량 측정
RAW264.7 세포를 12-well plate에 3.0 × 105 cells/well로 분주한 후 24시간 안정화하였다. 세포는 AN-EA 50, 100 및 200 ㎍/mL로 2시간 전처리한 뒤 LPS 1 ㎍/mL를 처리하여 24시간 동안 염증반응을 유도하였다. 배양 상등액을 회수한 후 동일 부피의 Griess reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)와 혼합하여 실온에서 15분간 반응시켰다. 15분 후 흡광도는 540 ㎚에서 측정하였다. LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 AN-EA가 PGE2생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 배양 상등액을 회수하였다. PGE2 농도는 제조사의 지침에 따라 PGE2 ELISA kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다.
SDS-PAGE 및 Western blot 분석
AN-EA가 iNOS, COX-2, MAPKs, ATF-2, NF-κB p65, Nrf2, HO-1 및 PI3K 단백질 발현 또는 인산화에 미치는 영향을 분석하기 위하여 Western blot을 수행하였다. 세포는 ice-cold PBS로 세척한 후 RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 단백질을 추출하였다. 단백질 농도는 Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 정량하였다. 동일량의 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 뒤 PVDF membrane으로 전이하였다. Membrane은 5% skim milk로 blocking한 후 1차 항체를 처리하여 4℃에서 overnight 반응시켰다. 이후 HRP-conjugated 2차 항체를 상온에서 1시간 처리하고, ECL Select Western Blot ting Detection Reagent (Cytiva, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 단백질 밴드를 LI-COR C-DiGit Blot Scanner (LI-COR Bio sciences, Lincoln, NE, USA)로 검출하였다.
mRNA 발현 분석
AN-EA가 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 total RNA를 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)로 추출하였다. 추출한 RNA는 Verso cDNA Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. PCR 증폭은 PCR Master Mix Kit (Promega, Madison, WI, USA)와 iNOS 프라이머를 사용하여 수행되었다. 본 연구에서 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다. iNOS는 forward 5′-GTGCTGCCTCTGGTCTTGCAAGC-3′ 및 reverse 5′-AGGGGCAGGCTGGGAATTCG-3′, COX-2는 forward 5′-GGAGAGACTATCAAGATAGTGATC-3′ 및 reverse 5′-ATGGTCAGTAGACTTTTACAGCTC-3′, GAPDH는 forward 5′-CAGGAGCGAGACCCCACTAACAT-3′ 및 reverse 5′-GTCAGATCCACGACGGACACATT-3′를 사용하였다. GAPDH는 internal control로 사용하였다.
통계분석
모든 실험은 최소 3회 이상 독립적으로 반복 수행하였다. 결과는 mean ± SD으로 나타내었다. 통계분석은 GraphPad Prism 버전 5.0 (GraphPad Software, Inc.) 프로그램을 이용하여 one-way analysis of variance (ANOVA)를 실시한 후 Bonferroni 사후 검정을 통해 진행하였다. p<0.05를 통계적으로 유의한 차이로 판단하였다.
결 과
AN-EA의 RAW264.7 세포에서 LPS 매개 NO 및 PGE2생성 억제 효과
LPS로 자극된 RAW264.7 세포는 NO와 PGE2를 포함한 다양한 염증 매개물질을 생성하므로, 이 모델은 천연물 유래 항염증 후보소재의 효능 평가에 널리 이용된다(Choi et al., 2020; Kim et al., 2018). 본 연구에서는 먼저 AN-EA가 LPS로 유도된 NO 생성에 미치는 영향을 확인하였다. LPS 단독 처리군에서는 정상 대조군에 비해 NO 생성량이 현저히 증가하였다. 그러나 AN-EA를 50, 100 및 200 ㎍/mL 농도로 처리한 결과, LPS에 의해 증가한 NO 생성이 농도의존적으로 감소하였다(Fig. 1A). NO는 주로 iNOS에 의해 생성되므로 이러한 결과는 AN-EA가 LPS 매개 iNOS/NO 축을 조절할 가능성을 시사한다(MacMicking et al., 1997; Moncada et al., 1991). 다음으로 AN-EA가 PGE2생성에 미치는 영향을 평가하였다. LPS 처리에 의해 RAW264.7 세포의 PGE2생성은 뚜렷하게 증가하였다. 그러나 AN-EA 50, 100 및 200 ㎍/mL 처리는 LPS로 유도된 PGE2생성을 농도의존적으로 억제하였다(Fig. 1B). PGE2는 COX-2에 의해 생성되는 대표적 염증성 prostaglandin으로, 염증부위의 혈관확장, 통증, 발열 및 염증세포 활성과 관련된다(Ricciotti and FitzGerald, 2011; Vane and Botting, 1987). 따라서 AN-EA의 PGE2 억제효과는 COX-2 발현 조절과 관련될 가능성이 있다.
Fig. 1.
Effects of AN-EA on LPS-induced inflammatory mediator production, iNOS/COX-2 expression, and cell viability in RAW264.7 macrophages. RAW264.7 cells were pretreated with AN-EA at the indicated concentrations (50, 100, and 200 ㎍/mL) for 2 h and then stimulated with LPS (1 ㎍/mL) for 24 h. (A) NO production was measured using the Griess reaction. (B) PGE2 production was determined using an ELISA kit. (C) Protein levels of iNOS and COX-2 were analyzed by Western blotting. (D) mRNA expression levels of iNOS and COX-2 were determined by RT-PCR. (E) Cell viability was assessed using MTT assay. Data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. *p < 0.05 compared with the untreated control group (CON), *p< 0.05 compared with the LPS-treated group.
AN-EA의 LPS 매개 iNOS 및 COX-2 단백질 및 mRNA 발현 억제 효과
NO와 PGE2생성 억제가 iNOS 및 COX-2 발현 조절에 의한 것인지 확인하기 위해 Western blot 분석을 수행하였다. LPS 단독 처리군에서는 iNOS 및 COX-2 단백질 발현이 현저히 증가하였다. 반면 AN-EA 50, 100 및 200 ㎍/mL 처리군에서는 LPS로 증가한 iNOS 및 COX-2 단백질 수준이 농도의존적으로 감소하였다(Fig. 1C). iNOS 및 COX-2는 LPS로 활성화된 대식세포에서 NO와 PGE2생성의 핵심 효소로 작용하므로 AN-EA에 의한 이들 단백질 발현 억제는 NO 및 PGE2생성 감소와 직접적으로 연결될 수 있다(MacMicking et al., 1997; Ricciotti and FitzGerald, 2011; Vane and Botting, 1987). 또한 AN-EA는 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현 역시 농도의존적으로 감소시켰다(Fig. 1D). 이는 AN-EA가 iNOS와 COX-2 단백질 안정성에만 영향을 주는 것이 아니라, 전사 수준 또는 mRNA 축적 수준에서 염증성 유전자 발현을 억제할 수 있음을 의미한다. LPS에 의해 유도되는 iNOS 및 COX-2 발현은 NF-κB 및 MAPK 관련 전사조절에 의해 크게 영향을 받기 때문에, 이러한 결과는 AN-EA가 상위 염증 신호전달계를 조절할 가능성을 제시한다(Guha and Mackman, 2001; Li and Verma, 2002; Lawrence, 2009). AN-EA의 NO 및 PGE2생성 억제가 세포독성에 의한 비특이적 결과인지 확인하기 위해 세포생존율을 측정하였다. AN-EA는 50, 100 및 200 ㎍/mL 농도에서 RAW264.7 세포의 생존율에 유의적인 영향을 미치지 않았다(Fig. 1C). 따라서 AN-EA에 의한 NO, PGE2, iNOS 및 COX-2 억제효과는 세포사멸이나 증식억제에 따른 2차적 현상이 아니라 염증반응 조절에 의한 특이적 항염증 효과로 판단된다(Choi et al., 2020; Kim et al., 2018).
AN-EA의 LPS 매개 MAPK/ATF-2와 NF-κB 신호전달 활성화 억제 효과
LPS로 활성화된 대식세포에서 MAPK 신호는 iNOS, COX-2 및 염증성 사이토카인 발현을 조절하는 주요 상위기전이다(Arthur and Ley, 2013; Kaminska, 2005). 이에 AN-EA가 LPS로 유도된 ERK1/2, p38 및 JNK 인산화에 미치는 영향을 확인하였다. LPS 단독 처리군에서는 ERK1/2, p38 및 JNK의 인산화가 증가하였다. 반면 AN-EA 100 및 200 ㎍/mL 처리는 LPS에 의해 증가한 ERK1/2, p38 및 JNK 인산화를 농도의존적으로 감소시켰다(Fig. 2A). 이러한 결과는 AN-EA가 LPS-TLR4 하위에서 활성화되는 MAPK 신호전달을 억제함으로써 염증성 유전자 발현을 조절할 수 있음을 보여준다(Arthur and Ley, 2013; Guha and Mackman, 2001; Takeda and Akira, 2004). ATF-2는 p38 및 JNK를 포함한 MAPK 신호에 의해 조절되는 전사인자로 염증성 유전자 발현 조절에 관여한다(Reimold et al., 2001; Kim et al., 2018). 본 연구에서 LPS는 ATF-2 인산화를 증가시켰으나 AN-EA는 LPS에 의해 증가한 ATF-2 인산화를 농도의존적으로 억제하였다(Fig. 2A). 선행 연구에서도 LPS로 활성화된 RAW264.7 세포에서 MAPK/ATF-2 신호 억제가 NO 및 염증성 매개인자 생성 감소와 관련됨이 제시되었다(Kim et al., 2018). 따라서 AN-EA에 의한 MAPK/ATF-2 억제는 iNOS 및 COX-2 발현 감소에 기여하는 주요 기전으로 해석된다.
Fig. 2.
Effects of AN-EA on LPS-induced MAPK/ATF-2 and NF-κB p65 phosphorylation in RAW264.7 macrophages. RAW264.7 cells were pretreated with AN-EA (100 and 200 ㎍/mL) for 2 h and then stimulated with LPS (1 ㎍/mL) for 30 min. (A) Phosphorylation levels of ERK1/2, p38, JNK, and ATF-2 were analyzed by Western blotting. (B) Phosphorylation of NF-κB p65 was analyzed by Western blotting. Total forms of each signaling protein or β-actin were used as loading controls. Data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. *p < 0.05 compared with the untreated control group (CON), *p < 0.05 compared with the LPS-treated group.
NF-κB는 LPS로 활성화된 대식세포에서 iNOS, COX-2 및 염증성 사이토카인의 전사를 유도하는 핵심 전사인자이다(Lawrence, 2009; Li and Verma, 2002). 본 연구에서 LPS 단독 처리군은 NF-κB p65 인산화를 증가시켰다. 그러나 AN-EA 100 및 200 ㎍/mL 처리는 LPS로 유도된 p65 인산화를 농도의존적으로 억제하였다(Fig. 2B). p65 인산화는 NF-κB 전사활성 증가와 밀접하게 관련되므로 AN-EA에 의한 p65 인산화 억제는 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현 감소와 연결될 수 있다(Hayden and Ghosh, 2012; Li and Verma, 2002).
이상의 결과는 AN-EA가 LPS로 유도된 염증반응을 단일 표적이 아니라 MAPK/ATF-2와 NF-κB p65 신호를 동시에 억제하는 방식으로 조절함을 의미한다. 이는 AN-EA가 NO 및 PGE2생성뿐 아니라 iNOS와 COX-2 발현을 함께 억제한 결과와도 잘 부합한다(Choi et al., 2020; Guha and Mackman, 2001; Kim et al., 2018).
AN-EA의 RAW264.7 세포에서 Nrf2/HO-1 신호전달 활성화 효과
Nrf2/HO-1 경로는 대식세포에서 산화스트레스와 염증반응을 완화하는 대표적인 세포보호 신호축이다(Alam et al., 1999; Kensler et al., 2007; Paine et al., 2010). 이에 AN-EA가 Nrf2 및 HO-1 단백질 발현에 미치는 영향을 시간대별로 분석하였다. RAW264.7 세포에 AN-EA 200 ㎍/mL을 1, 3, 6, 10 및 24시간 처리한 결과, Nrf2 단백질 수준은 AN-EA 처리 1시간부터 증가하였다(Fig. 3). 반면 HO-1 단백질 수준은 AN-EA 처리 6시간부터 증가하였다(Fig. 3). Nrf2는 HO-1 발현을 조절하는 상위 전사인자이므로 Nrf2 증가가 HO-1 증가보다 선행한 본 연구 결과는 AN-EA가 Nrf2 활성화를 통해 HO-1 발현을 유도할 가능성을 뒷받침한다(Alam et al., 1999; Kensler et al., 2007). RAW264.7 세포에서 Nrf2/HO-1 경로의 활성화는 LPS로 유도된 NO, PGE2, iNOS 및 COX-2 생성을 억제하는 항염증 기전으로 보고되어 왔다(Park et al., 2013; Xu et al., 2015; Yao et al., 2019). 따라서 AN-EA의 항염증 효과는 MAPK/NF-κB 억제뿐 아니라 Nrf2/HO-1 경로 활성화와도 관련될 수 있다.
Fig. 3.
Effects of AN-EA on Nrf2 and HO-1 protein expression in RAW264.7 macrophages. RAW264.7 cells were treated with AN-EA (200 ㎍/mL) for 1, 3, 6, and 10 h. Protein levels of Nrf2 and HO-1 were determined by Western blotting. β-actin was used as an internal control. Data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. *p < 0.05 compared with the untreated control group (CON).
AN-EA 매개 Nrf2/HO-1 활성화에 대한 PI3K 신호전달 의존성
AN-EA가 Nrf2/HO-1 경로를 활성화하는 상위기전을 확인하기 위해 PI3K inhibitor인 LY294002를 사용하였다. AN-EA 200 ㎍/mL 처리군에서는 Nrf2 및 HO-1 단백질 수준이 증가하였으나 LY294002 전처리는 AN-EA에 의해 증가한 Nrf2 및 HO-1 단백질 수준을 억제하였다(Fig. 4A). 이는 AN-EA에 의한 Nrf2/HO-1 활성화에 PI3K 신호가 관여함을 의미한다. 선행 연구에서도 RAW264.7 세포에서 PI3K/Akt 활성화가 Nrf2/HO-1 발현 유도와 LPS 매개 산화스트레스 억제에 관여한다고 보고되었다(Xu et al., 2015). 따라서 AN-EA는 PI3K 의존적으로 Nrf2/HO-1 경로를 활성화하는 것으로 판단된다.
ROS는 염증반응을 악화시키는 산화적 스트레스 인자로 작용할 수 있지만 동시에 세포보호 신호를 유도하는 redox-sensitive signaling molecule로도 작용할 수 있다(Kensler et al., 2007; Xu et al., 2015). 본 연구에서는 ROS scavenger인 NAC를 이용하여 AN-EA에 의한 Nrf2/HO-1 활성화에서 ROS의 관여 여부를 확인하였다. NAC 전처리는 AN-EA 200 ㎍/mL에 의해 증가한 Nrf2 및 HO-1 단백질 수준을 억제하였다(Fig. 4B). 이는 AN-EA가 유도하는 Nrf2/HO-1 경로 활성화가 ROS 의존적 신호전달과 관련됨을 의미한다.
또한 AN-EA는 RAW264.7 세포에서 15분, 30분, 1시간 및 2시간 처리 중 15분부터 PI3K 인산화를 증가시켰다(Fig. 4C). 그러나 NAC 전처리는 AN-EA에 의해 증가한 PI3K 인산화를 억제하였다(Fig. 4D). 이러한 결과는 AN-EA가 ROS-sensitive mechanism을 통해 PI3K를 활성화하고, 이후 Nrf2/HO-1 경로를 유도한다는 기전적 흐름을 제시한다. 유사하게 최근 연구에서도 NAC가 천연물에 의해 유도된 PI3K 활성화와 Nrf2/HO-1 증가를 억제하는 결과가 보고되어 ROS/PI3K/Nrf2/HO-1 축의 항염증적 의미가 제시되었다(Choi et al., 2025; Lee et al., 2025).
Fig. 4.
Involvement of ROS-dependent PI3K signaling in AN-EA-induced Nrf2/HO-1 activation in RAW264.7 macrophages. RAW264.7 cells were pretreated with LY294002 or NAC for 2 h and then treated with AN-EA (200 ㎍/mL) for 6 h. (A) Effects of LY294002 on AN-EA-induced Nrf2 and HO-1 protein expression were analyzed by Western blotting. (B) Effects of NAC on AN-EA-induced Nrf2 and HO-1 protein expression were analyzed by Western blotting. (C) RAW264.7 cells were treated with AN-EA (200 ㎍/mL) for 15 min, 30 min, 1 h, and 2 h, and PI3K phosphorylation was analyzed by Western blotting. (D) RAW264.7 cells were pretreated with NAC for 2 h and then treated with AN-EA (200 ㎍/mL) for 1 h. Effects of NAC on AN-EA-induced PI3K phosphorylation were determined by Western blotting. Data are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. *p < 0.05 compared with the untreated control group (CON).
고 찰
본 연구는 털목이버섯(Auricularia nigricans) 에틸아세테이트 분획물(AN-EA)이 LPS로 활성화된 RAW264.7 대식세포에서 항염증 활성을 나타내며, 그 작용기전이 MAPK/NF-κB 신호 억제와 ROS/PI3K/Nrf2/HO-1 경로 활성화라는 이중 조절기전과 관련됨을 제시한다. LPS로 활성화된 대식세포는 NO와 PGE2를 포함한 염증 매개물질을 과도하게 생성하며, 이러한 반응은 iNOS 및 COX-2 발현 증가와 밀접하게 연결된다(MacMicking et al., 1997; Moncada et al., 1991; Ricciotti and FitzGerald, 2011). 본 연구에서 AN-EA는 50–200 ㎍/mL 농도에서 세포생존율에 영향을 주지 않으면서 LPS로 증가한 NO 및 PGE2생성을 농도의존적으로 억제하였다. 또한 AN-EA는 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현뿐 아니라 mRNA 발현도 감소시켰다. 이는 AN-EA가 염증 매개효소의 전사적 조절단계에 작용하여 NO와 PGE2생성을 억제할 수 있음을 의미한다. 천연물의 항염증 효과가 세포독성 없이 iNOS/NO와 COX-2/PGE2축을 억제하는 방식으로 나타난다는 점은 여러 RAW264.7 기반 연구에서 공통적으로 제시되어 왔다(Choi et al., 2020; Fang et al., 2021; Kim et al., 2018). AN-EA가 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현을 억제했다는 결과는 상위 전사조절 신호의 관여 가능성을 강하게 시사한다.
LPS-TLR4 신호는 MyD88-dependent 또는 TRIF-dependent pathway를 통해 MAPKs와 NF-κB를 활성화하며, 이들 신호는 iNOS, COX-2 및 염증성 사이토카인 유전자 발현을 유도한다(Lawrence, 2009; Lu et al., 2008; Takeda and Akira, 2004). 본 연구에서 AN-EA는 LPS로 증가한 ERK1/2, p38 및 JNK 인산화를 농도의존적으로 억제하였다. MAPK는 염증성 전사인자 활성화와 염증성 유전자 발현 조절에 필수적인 신호전달계로 알려져 있으므로 AN-EA의 MAPK 억제는 iNOS 및 COX-2 감소의 중요한 상위기전으로 해석된다(Arthur and Ley, 2013; Kaminska, 2005; Kyriakis and Avruch, 2012). ATF-2는 MAPK 신호 하위에서 활성화되는 전사인자로서 염증성 유전자 발현 조절에 관여한다(Reimold et al., 2001). 본 연구에서 AN-EA는 LPS 매개 ATF-2 인산화를 억제하였다. 이는 AN-EA가 MAPK 신호 자체뿐 아니라 MAPK 하위 전사조절 단계까지 억제함을 의미한다. 특히 선행 연구에서 acacia honey가 LPS로 유도된 ERK1/2, p38 및 ATF-2 인산화를 억제하여 항염증 효과를 나타낸다고 보고된 점을 고려하면 MAPK/ATF-2 축은 RAW264.7 세포에서 천연물 유래 항염증 소재의 중요한 표적으로 볼 수 있다(Kim et al., 2018).
NF-κB는 대식세포 염증반응에서 가장 핵심적인 전사인자 중 하나이다(Lawrence, 2009; Li and Verma, 2002). LPS 자극은 IκB 분해와 p65 인산화 및 핵 이동을 유도하여 염증성 유전자 전사를 증가시킨다(Hayden and Ghosh, 2012; Li and Verma, 2002). 본 연구에서 AN-EA는 LPS로 증가한 NF-κB p65 인산화를 농도의존적으로 억제하였다. 이러한 결과는 AN-EA가 iNOS 및 COX-2 mRNA 발현을 감소시킨 이유를 설명할 수 있는 핵심 근거이다. 즉 AN-EA는 MAPK/ATF-2 및 NF-κB p65 신호를 동시에 억제함으로써 LPS 자극에 의해 유도되는 염증성 유전자 발현을 전사 수준에서 하향 조절하는 것으로 판단된다.
본 연구에서 특히 주목할 점은 AN-EA가 염증 신호를 억제하는 동시에 Nrf2/HO-1 세포보호 경로를 활성화했다는 것이다. Nrf2는 ARE-dependent gene expression을 통해 HO-1과 같은 항산화 효소 발현을 유도하며, HO-1은 heme 대사산물을 통해 산화스트레스와 염증반응을 완화하는 데 기여한다(Alam et al., 1999; Paine et al., 2010; Ryter and Choi, 2016). AN-EA 처리 후 Nrf2 단백질 수준은 1시간부터 증가하였고, HO-1 단백질 수준은 6시간부터 증가하였다. 이러한 시간적 순서는 Nrf2가 HO-1의 상위 조절인자로 기능한다는 기존 지식과 잘 부합한다(Alam et al., 1999; Kensler et al., 2007). 따라서 AN-EA에 의해 선행적으로 증가한 Nrf2가 HO-1 발현을 유도하고, 이 경로가 LPS 매개 염증반응 억제에 기여했을 가능성이 높다. Nrf2/HO-1 경로와 항염증 효과의 관련성은 여러 RAW264.7 세포 연구에서 보고되어 왔다. Inula helenium 추출물은 Nrf2/HO-1 유도를 통해 LPS로 유도된 iNOS/NO 및 COX-2/PGE2생성을 억제하였으며, HO-1 knockdown은 이러한 항염증 효과를 약화시켰다(Park et al., 2013). Punicalagin은 PI3K/Akt-Nrf2/HO-1 경로를 활성화하여 LPS로 유도된 산화스트레스 및 염증반응을 억제하였다(Xu et al., 2015). Nardochinoid B 역시 Nrf2/HO-1 활성화를 통해 RAW264.7 세포의 LPS 매개 활성화를 억제하였다(Yao et al., 2019). 이러한 선행연구들은 AN-EA에 의한 Nrf2/HO-1 증가가 단순한 항산화 반응이 아니라 항염증 작용기전의 핵심 요소일 가능성을 뒷받침한다.
AN-EA의 Nrf2/HO-1 활성화 상위기전을 규명하기 위해 본 연구에서는 LY294002와 NAC를 사용하였다. LY294002는 AN-EA에 의해 증가한 Nrf2 및 HO-1 단백질 수준을 억제하였다. 이는 AN-EA가 PI3K 의존적으로 Nrf2/HO-1 경로를 활성화한다는 것을 의미한다. PI3K/Akt 신호가 Nrf2 안정화 및 HO-1 발현 증가에 관여한다는 보고는 RAW264.7 세포에서 이미 제시된 바 있다(Xu et al., 2015). 따라서 AN-EA의 PI3K 의존적 Nrf2/HO-1 활성화는 기존 연구와 일치하는 생물학적으로 타당한 결과이다. 또한 NAC는 AN-EA에 의해 증가한 Nrf2 및 HO-1뿐 아니라 PI3K 인산화도 억제하였다. 이는 AN-EA가 유도하는 PI3K 활성화가 ROS-dependent event임을 의미한다. 일반적으로 ROS는 염증과 산화손상을 유발하는 부정적 인자로 인식되지만, 일정 수준의 일시적 ROS는 Nrf2를 활성화하는 생리적 redox signal로 작용할 수 있다(Kensler et al., 2007; Xu et al., 2015). 따라서 AN-EA는 세포독성을 유발하지 않는 범위에서 ROS-sensitive PI3K 신호를 활성화하고, 이를 통해 Nrf2/HO-1 경로를 유도하는 것으로 해석된다. 이러한 기전은 최근 Pleurotus citrinopileatus 및 Cirsium nipponicum 관련 연구에서 제시된 ROS/PI3K/Nrf2/HO-1 축과도 유사하다(Choi et al., 2025; Lee et al., 2025).
종합하면 AN-EA의 항염증 효과는 두 가지 상호보완적 기전으로 설명할 수 있다. 첫째, AN-EA는 LPS로 유도된 ERK1/2, p38, JNK, ATF-2 및 NF-κB p65 인산화를 억제하여 iNOS와 COX-2의 전사 및 단백질 발현을 감소시키고, 그 결과 NO와 PGE2생성을 억제한다. 둘째, AN-EA는 ROS 의존적 PI3K 활성화를 통해 Nrf2/HO-1 경로를 유도함으로써 염증성 스트레스에 대한 세포보호적 방어반응을 강화한다. 이러한 결과는 AN-EA가 대식세포 매개 염증반응을 조절할 수 있는 천연물 유래 기능성 소재로 활용될 가능성을 제시한다. 다만 본 연구는 RAW264.7 세포를 이용한 in vitro 수준의 연구이므로, AN-EA의 생체 내 항염증 효능과 안전성을 검증하기 위해서는 LPS 유도 급성염증 또는 염증성 질환 동물모델을 이용한 후속 연구가 필요하다. 또한 AN-EA는 분획물 수준의 시료이므로, 향후 LC-MS/MS, HPLC 또는 GC-MS 기반 성분분석을 통해 주요 활성성분을 규명하고, 개별 성분과 복합성분의 기여도를 비교하는 연구가 필요하다.
적 요
본 연구는 털목이버섯(Auricularia nigricans) 에틸아세테이트 분획물(AN-EA)이 LPS로 활성화된 RAW264.7 대식세포에서 세포독성 없이 NO 및 PGE2생성을 농도의존적으로 억제함을 확인하였다. AN-EA는 LPS로 유도된 iNOS 및 COX-2의 단백질 및 mRNA 발현을 감소시켰으며, 이는 AN-EA가 염증 매개효소의 전사 및 번역 수준 발현을 조절함을 의미한다. 또한 AN-EA는 LPS 매개 ERK1/2, p38, JNK, ATF-2 및 NF-κB p65 인산화를 억제하였다. 한편 AN-EA는 Nrf2 및 HO-1 단백질 수준을 시간의존적으로 증가시켰으며, LY294002와 NAC 처리 결과 AN-EA에 의한 Nrf2/HO-1 활성화가 ROS 의존적 PI3K 신호와 관련됨을 확인하였다. 따라서 AN-EA는 MAPK/NF-κB 염증 신호 억제와 ROS/PI3K/Nrf2/HO-1 세포보호 신호 활성화를 통해 대식세포 매개 염증반응을 조절하는 천연 항염증 소재로 활용될 가능성이 있다.
