서 언
풋귤(Citrus reticulata Blanco)은 미성숙과 감귤로 완숙과 감귤보다 높은 식이섬유, 유기산, 폴리페놀 및 플라보노이드 등을 함유한 것으로 알려져 있으며 특히 채집 시기가 이른 시기일수록 더 높은 폴리페놀, 플라보노이드 함량을 가진 것으로 밝혀져 있다(Hyeon, 2021). 플라보노이드는 체내에서 매우 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 특히 활성산소의 소거제와 금속이온의 착염제로서 체내에서 강력한 항산화능을 나타내며, 몇몇 효소의 활성을 억제하거나 발현을 유도하는 기능도 있다고 알려져 있다(Jung et al., 2000). 이러한 항산화 효과를 가진 플라보노이드는 이미 과한 운동 시 NO 생성을 자극하고 혈관 확장을 유발하여 혈류를 개선하고 혈압을 낮추며 운동하는 동안 근육으로의 산소와 영양소 운반을 증가시켜 피로 대사산물을 제거한다는 점이 보고 되었다(Overdevest et al., 2018). 또한, LDH (lactate dehydrogenase) 활성 감소 및 혈중 젖산 농도 조절을 통해 피로를 완화하고 운동 지속 능력을 증가시켜(Kim et al., 2014), 플라보노이드가 단순히 피로 완화뿐만 아니라 운동 능력 향상에도 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사하고 있다(Na et al., 2013).
운동 피로는 운동 시에 발생한 생리기능의 활성화에 의한 에너지 요구량에 대하여 공급이 충족되지 못하는 상태가 되어 느끼는 피로이며, 허혈이나 장기의 장애를 일으키기도 한다(Fujiwara and Maede, 2001). 운동 피로를 유발하는 주요 물질은 젖산(lactate)으로 운동 시 골격근 세포들은 적절한 에너지 공급을 위해 산소요구량이 급격히 증가하는데 이때 근육 세포들의 대사가 산소요구량을 충족시키지 못할시 근육 세포에는 일시적 무산소 대사에 의한 에너지 공급 상태가 되어 젖산의 생성과 축적으로 피로를 유발하게 된다(Song et al., 2005). 젖산이 축적되면서 세포 내 수소이온(H⁺) 농도 역시 함께 증가하며, 이는 세포 pH 감소 및 근육 산성화를 초래하는 것으로 알려져 있다(Laski and Wesson, 2002). 따라서 pH가 낮아지면 효소 활성 저하, 칼슘(Ca2+) 조절 기능 손상, 근섬유 수축 능력 감소 등의 현상이 나타나며, 결국 운동 능력이 저하되게 된다(Yoon, 2018).
따라서, 본 연구에서는 이러한 선행연구를 바탕으로 풋귤 열수 추출물의 운동 능력 향상성을 관찰하여 새로운 기능성 입증을 하고자 한다.
재료 및 방법
실험 동물
본 연구에 사용한 실험 동물은 5주령 C57BL/6 수컷 생쥐(Hana biotech, Korea)를 구매하여 1주간 순화·사육을 거친 후 실험에 사용하였다. 실험군은 운동시키지 않는 비운동대조군(NC), 운동시키는 운동대조군(EC), 풋귤 열수 추출물(PE) 100 ㎎/㎏ (PE100), 200 ㎎/㎏ (PE200) 및 400 ㎎/㎏ (PE400) 용량으로 총 5군으로 나누었으며 군당 8마리씩 배정하였다. 실험 동물 사육 시 조명 시간은 12시간(07:00 ~ 19:00) 주기로 설정하였고, 무균 음수와 실험동물사료(Samtako Bio Korea, Korea)는 자유롭게 섭취시켰다. 본 연구는 ㈜동남의화학연구원 동물실험윤리위원회(No. SEMI-22-013, Institutional Animal Care and Use Committee)의 방침 및 법규에 따라 진행되었다.
실험 물질 조제 및 경구투여
본 실험에서 사용한 풋귤은 제주특별자치도 제주시 애월읍에서 재배된 풋귤을 수확하여 사용하였으며, 종 동정은 국가생물종목록에 따라 Citrus reticulata (이명: Citrus unshiu)로 정리하였다. 풋귤 추출물은 풋귤과 물을 1:10 (W/V)의 비율로 60℃에 3시간 2회 환류 추출한 후 추출액 고형분 함량 대비 1:1 비율로 덱스트린을 혼합하여 감압 농축 후 동결건조하여 사용하였다. 풋귤 추출물의 지표 성분은 hesperidin으로 Sigma- aldrich사(USA)에서 구매하여 사용하였으며, YMC j’sphere ODS-H80 (4.6 ㎜ × 250 ㎜, 4 µm)을 이용하여 Waters Acquity H Class UPLC (Waters, USA)으로 분석하여 280 ㎚에서 측정하였다. 본 실험에 사용된 풋귤 추출물 분말 내 hesperidin 함량은 2.2 ㎎/g으로 분석되었다. 추출물은 분류된 군에 따라 400, 200, 100 ㎎/10 mL/㎏ 용량으로 주사 용수에 용해해 1일 1회 6주 경구투여하였으며, 운동대조군은 10 mL/㎏ 용량의 주사 용수를 투여하였다.
강제 운동
풋귤 추출물 투여가 생쥐의 운동 능력 향상을 평가하기 위해 강제 달리기와 강제 수영을 진행하였다. 강제 달리기 운동은 Dougherty et al. (2016)의 방법 인용하여 수행하였으며, 총 4주간 주 2회 Treadmill 초기 속도 10 m/min으로 시작하여 횟수별 점차 속도를 올려 최종 속도 18 m/min까지 최대 45분간 강제 운동을 시켰다. 강제 운동 종료 시점은 물리적자극(고기압공기)에도 움직이지 않는 시점이며, 최대 3회 물리적 자극을 준다. 운동군과 풋귤 추출물 투여군은 투여일 기준 3주차부터 6주차까지 총 4주간 주 2회 운동시켰으며 마지막 차수에 기록하였다. 비운동군은 별도 적응 훈련 없이 운동군과 풋귤 추출물군의 마지막 차수에 강제 운동을 시켜 기록을 측정하였다. 강제 수영은 Can et al. (2012)의 방법을 인용하여, 플라스틱 수조(50W × 40D × 50H ㎝)의 35 ㎝ 높이까지 물을 채운 후, 수중히터를 이용하여 수온을 일정하게(25±2℃) 유지하도록 한다. 강제 달리기 2일 후, 실험 종료 전날 동물 체중의 5%에 해당하는 추를 꼬리에 매달아 진행하였다. 수면 아래로 5초 이상 가라앉는 시기를 탈진 시점으로 측정하였으며, 최대 수영 시간은 10분으로 설정하였다.
생체시료 채취 및 생화학적 분석
실험 종료 후 실험 동물은 CO2 가스로 마취하여 처치하였으며 복부 대동맥에서 채혈하여 혈청 분리 시험관(Serum Separate Tube)에 담아 30분간 실온에 방치 후 1,700 xg 에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 또한, 간과 대퇴근을 적출하여 무게를 측정하고 동결 보관하였다. 분리한 혈청은 자동생화학분석기(Hitachi 7100, Japan)를 이용하여 Lactate dehydrogenase (LDH), Creatinine, Blood ureanitrogen (BUN), triglyceride, total cholesterol, LDL cholesterol과 HDL cholesterol 농도를 측정하였다.
통계학적 분석
통계적 검정은 Statview (ver.5.0.1) 통계 프로그램을 이용하였고, 각 분석 항목에 대한 통계적 유의성은 ANOVA test 실시 후, p<0.05 수준에서 Post Hoc in Fisher’s PLSD 로 사후 검정하였다.
결 과
강제 운동
풋귤 추출물이 운동 능력에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 6주간 생쥐에 투여한 후 6주차 마지막 운동 시 탈진 시까지 강제 트레드밀 운동을 시킨 결과 몸무게는 비운동대조군 및 운동대조군 대비 풋귤 추출물 투여군 모두에서 감소한 것으로 확인되었다(Table 1). 트레드밀 운동 시간의 경우 비운동대조군과 운동대조군은 각각 15.5±8.2분 과 24.2±4.3분이었으나 풋귤 추출물 100 ㎎/㎏ 복용한 군은 28.7±5.6분, 풋귤 열수 추출물 200 ㎎/㎏ 복용한 군은 32.6±5.3분, 풋귤 열수 추출물 400 ㎎/㎏ 복용한 군은 37.8±5.3분으로 운동대조군 대비 풋귤 추출물 200 ㎎/㎏ 이상부터 유의적으로 운동 시간이 늘어남을 확인할 수 있었으며, 농도 의존적으로 평균 운동 시간이 증가함을 나타냈다(Fig. 1). 또한, 6주 차 마지막 투여 후 강제 수영 능력을 측정한 결과 비운동대조군과 운동대조군은 각각 284.5±108.1초와 302.5±80.0초였으나 풋귤 추출물 100 ㎎/㎏ 복용한 군은 311.9±31.8초, 200 ㎎/㎏ 복용한 군은 379.5±67.5초, 400 ㎎/㎏ 복용한 군은 442.8±76.1초로 풋귤 열수 추출물 400 ㎎/㎏에서 운동대조군 대비 유의적으로 강제 수영 시간이 늘어난 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
Table 1.
Body weight changes (g) of mice.
| Group | Body weights (g) | ||
| Before | After | Gain | |
| NC | 21.540±0.555 | 26.022±1.669 | 4.936±1.374 |
| EC | 21.019±1.123 | 25.501±2.276 | 4.747±1.516 |
| PE100 | 20.883±0.556 | 23.522±0.730zy | 2.616±0.717zy |
| PE200 | 20.906±0.774 | 23.700±1.323zy | 2.724±0.912zy |
| PE400 | 20.724±0.705 | 24.231±2.125zy | 3.677±1.795zy |
Values are presented as mean ±SD of tissue weights (g) for each group (n=8). NC, non-exercise control. EC, exercise control. PE100, exercise with 100 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. PE200, exercise with 200 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. PE400, exercise with 400 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. zp<0.05, significant difference between the Non-exercise control and samples, yp<0.05 significant difference between the exercise control and samples.
Fig. 1.
Effects of immature mandarin extract on endurance capacity for treadmill. Values are mean ±S.D. of 8 mice in each group. *p<0.05, significance difference between the exercise control and samples. NC, non-exercise control. EC, exercise control. PE100, exercise with 100 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. PE200, exercise with 200 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. PE400, exercise with 400 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration.
Fig. 2.
Effects of immature mandarin extract on endurance capacity for swimming. Values are mean ±S.D. of 8 mice in each group. *p<0.05, significance difference between the exercise control and samples. NC, non-exercise control. EC, exercise control. PE100, exercise with 100 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. PE200, exercise with 200 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. PE400, exercise with 400 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration.
조직 무게 변화
실험 종료 후 실험 동물의 주요 장기를 육안으로 관찰한 결과 모든 동물에서 이상 병변은 발견되지 않았으며, 간 조직 무게 또한 유의적 무게 변화가 나타나지 않았다(Table 2). 대퇴근의 경우 풋귤 추출물을 투여한 모든 군에서 비운동대조군 대비 무게 증가가 나타났으며 농도 의존적으로 평균 근육량 증가가 확인되었다(Table 2).
Table 2.
Effect of immature mandarin extract on organ weight in mouse.
| Group | Tissue weights (g) | |
| Liver | Femoral muscle | |
| NC | 1.370±0.093 | 0.758±0.044 |
| EC | 1.298±0.123 | 0.788±0.040 |
| PE100 | 1.312±0.071 | 0.912±0.067z |
| PE200 | 1.271±0.127 | 0.950±0.041z |
| PE400 | 1.277±0.115 | 1.040±0.124z |
Values are presented as mean ±SD of tissue weights (g) for each group (n=8). NC, non-exercise control. EC, exercise control. PE100, exercise with 100 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. PE200, exercise with 200 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. PE400, exercise with 400 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. zp<0.05 significant difference between the exercise control and samples.
생화학적 분석
혈청 생화학분석 결과 BUN은 운동대조군 대비 PE100 군과 PE400 군에서 유의적으로(p<0.05) 감소하였으며, Total cholesterol은 운동대조군 대비 PE200 군에서 유의적으로(p<0.05) 감소하였다(Table 3). Creatinine은 모든 군에서 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, LDH는 비운동대조군 대비 운동대조군에서 유의적으로 증가함이 확인되었으며, 운동대조군 대비 모든 풋귤 추출물 투여군에서 유의적(p<0.05)로 감소하였다(Table 3). 이는 풋귤 열수 추출물이 LDH 감소시키며 운동 능력 향상에 도움을 주는 것으로 확인된다. 또한 4주간 트레드밀 훈련을 통하여 이러한 운동 능력 향상 작용으로 인하여 대퇴근육 증가가 이루어지는 것을 유추할 수 있다(Table 2).
Table 3.
Effect of immature mandarin extract on serum in mouse.
| Group |
BUN (㎎/dL) |
Total cholesterol (㎎/dL) |
Creatinine (㎎/dL) | LDH(U/L) |
Triglyceride (㎎/dL) |
HDL cholesterol (㎎/dL) |
LDL cholesterol (㎎/dL) |
| NC | 21.11±2.25 | 94.83±4.03 | 0.045±0.020 | 318.20±31.07 | 107.50±22.32 | 70.65±4.42 | 9.42±0.80 |
| EC | 23.70±2.94z | 93.10±9.06 | 0.050±0.022 | 397.06±27.38z | 83.07±13.54z | 71.12±5.73 | 10.72±0.79z |
| PE100 | 20.86±1.29y | 93.83±8.44 | 0.052±0.017 | 300.73±57.02y | 114.98±36.14y | 67.06±2.79 | 10.75±2.49 |
| PE200 | 23.02±1.56 | 84.49±6.33zy | 0.045±0.018 | 321.35±57.79y | 112.77±16.60y | 64.54±4.52y | 9.10±0.81y |
| PE400 | 21.13±2.43y | 88.37±5.63 | 0.047±0.013 | 274.08±58.26y | 117.38±19.00y | 65.34±3.49y | 10.03±0.88 |
Values are presented as mean ±SD of serum level for each group (n=8). NC, non-exercise control. EC, exercise control. PE100, exercise with 100 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. PE200, exercise with 200 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. PE400, exercise with 400 ㎎/㎏ immature mandarin extract administration. zp<0.05, significant difference between the Non-exercise control and samples, yp<0.05 significant difference between the exercise control and samples.
고 찰
감귤류에는 hesperidin, narirutin과 같이 항산화, 항암, 항염증, 항비만 활성이 있는 플라바논 배당체가 풍부히 들어있으며(Burke et al., 2018; Kim et al., 2018; Revathy et al., 2018), 특히 미성숙 감귤인 풋귤은 숙성된 감귤보다 플라바논 함량이 높아 플라보노이드 보충제로도 좋은 원료로 알려져 있다(Kim and Kim, 2017). 이를 활용하여 최근 발효물 제조를 통한 풋귤의 면역증진 효과 및 성분규명 연구를 하며 다방면 활용성 제고가 활발하게 이루어 지고 있다(Yoon, 2025). 본 연구에서는 강제 운동 부하를 통해 근육 손상을 유발한 생쥐에 풋귤 추출물을 경구투여하여 운동 능력 향상 여부 및 젖산탈수소효소와 같이 근육 손상 및 피로 인자를 확인해 풋귤의 신규 기능성 규명하고자 하였다.
본 실험에서 풋귤 추출물 투여 3주차부터 6주차까지 총 4주간 주 2회 Treadmill 강제 운동을 통하여 운동 적응 및 풋귤 추출물의 운동 능력 향상을 확인하고자 하였으며, 실험 종료 전날 강제 수영을 통해 운동 부하를 최대한 유발하여 풋귤 추출물의 운동 능력 향상 및 원인을 분석하고자 하였다. Treadmill 결과를 확인한 결과 PE200 군과 PE400 군에서 유의적 운동 시간 증가가 나타났으며(Fig. 1), 강제 수영 결과에서도 PE400 군에서 유의적 운동 시간 증가가 나타났다(Fig. 2). 이는 풋귤 추출물이 운동 능력 향상 기능성을 나타낸 것으로 유추할 수 있으며, 대퇴근 무게 측정에서도 PE군 모두 비운동대조군 대비 유의적 증가가 확인되어 근력 향상에도 효과를 보이는 것으로 확인되었다(Table 2). 분말화 제형을 위하여 투여한 덱스트린의 영향으로 탄수화물 보충에 따른 변화가 나타날 가능성은 있으나, 체중이 증가하지 않은 점과 LDH와 같은 근육 손상 지표의 변화로 보았을 때 풋귤 자체의 운동 능력 향상 효과가 있을 것으로 판단한다. Loegering (1974)의 연구에 의하면 흰쥐 대상 수영이나 Treadmill 운동 후 혈장 효소 수치에서 LDH (lactate dehydronase) 수치가 높아지는 것이 확인되었으며, 이는 골격근의 부담이 증가하여 근 손상의 지표로 나타난다. 또한 LDH는 운동으로 인한 산소 부족시 근육에서 무산소성 당 분해작용에 의해 생성되는 pyruvate를 재산화하여 lactic aicd로 환원시키며(Jack and David, 2001), 근육 피로가 회복되는 과정에서 lactic acid 함량이 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Bermeyer, 1974). 본 실험의 강제 수영 후 혈청 생화학분석 시 비운동대조군 대비 운동대조군의 LDH 수치가 증가하는 것을 확인했으며, 이는 과도한 운동으로 인해 근 손상이 일어났으며 젖산 합성 기전을 통해 근피로를 유발할 수 있다(Table 3). 그러나 PE 군 모두에서 운동대조군 대비 LDH 수치가 유의적 감소하는 것이 확인되어 풋귤 추출물이 근 손상이 줄어든 것으로 확인되며, 감소한 LDH로 인하여 젖산 생성이 줄어들 가능성이 있으므로 후속 연구를 통해 근피로 개선을 통한 운동 능력 향상을 규명할 가치가 있다. 종합적으로 분석해 보았을 때 풋귤 추출물은 운동 능력을 향상시키며, 대퇴 근육을 증가시킴으로 새로운 기능성 원료로써의 가능성을 가지고 있다.
