서 언
재료 및 방법
식물재료
추출물 제조
동결건조 수율 비교
DPPH 라디칼 소거능
총 폴리페놀 함량 측정
통계학적 유의성 분석
결과 및 고찰
동결건조 수율 비교
DPPH 라디칼 소거능 비교
총 폴리페놀 함량 비교
적 요
서 언
향괴나무(Cladrastis platycarpa (Max.) Makino)는 콩목(Fabales) 콩과(Fabaceae)에 속하는 낙엽성 교목으로 주로 중국남부 및 중부, 일본 혼슈의 중부와 남부, 시코쿠지방에 분포하는 것으로 알려져 있다. 향괴나무의 수고는 2 m 이상이며 잎은 호생하고, 우상복엽으로 소엽병이 있다. 줄기는 어두운 회색이며 피목이 발달하는 특징을 보이고, 흰색의 꽃은 5월에 개화하고 원추화서의 형태로 가지 끝에 30~40 ㎝ 길이로 달린다. 열매는 협과로 초록색이고 안에 검은 종자가 1~3개 달린다(Kim and Kim, 2020). 국내에서는 유일하게 충북대학교 내 수목원에서 자생하는 것으로 알려져 있다. 특히 일본산 향괴나무의 경우, 목재의 건조 시료를 이용한 메탄올 추출물에서 Pseudobaptigenin, Cladrastin, Bayn 등의 isoflavonone계 물질을 분리하고, 그 구조를 밝히거나(Ohashi et al., 1976, 1977), -2,3-dihydroxy-8,9-methylenedioxypterocarpan과 같은 새로운 pterocarpan계 물질(Mizuno et al., 1990)을 분리 동정하는 등 전체 식물체 중 목재조직에서만 제한적으로 추출물의 성분이 보고된 바 있다. 최근에는 천연자원으로서 식물이 함유하고 있는 물질이나 그 효능에 대한 관심이 증가하면서, 각 식물을 대상으로 부위별로 세분하여 다양한 방식으로 추출물을 제작하여 그 효능을 검증하거나 이와 반대로 여러 식물의 추출물을 복합적으로 활용하여 효율을 극대화하는 등 다양한 시도가 이루어지고 있다. 질소고정 능력을 가지고 있는 것으로 잘 알려져 있는 콩과식물은 식용 및 약용자원으로 광범위하게 이용되고 있으며, 향괴나무와 근연으로 알려져 있는 다릅나무(Maackia amurensis Rupr.)를 포함하여 다양한 콩과식물이 높은 에스트로겐 활성을 보이는 것으로 알려져 있다(Bae et al., 2021). 이 외에도 등나무(Wisteria floribunda (Willd.) DC.)의 꽃 추출물이 천연 항산화제로서의 잠재적 가능성을 가지고 있다고 알려져 있고(Oh et al., 2008), 회화나무(Sophora japonica L.)의 경우에도 부위별 추출물 혹은 혼합 추출물을 이용하여 항산화, 항염, 항균, 탈모 개선, 피부 개선 효능이 있음이 보고되기도 하였다(Li et al., 2022; Park et al., 2022; Yoo et al., 2024).
일반적으로 산소가 안정된 분자 형태인 것과 비교하여 활성산소(reactive oxygen species, ROS)란 다른 분자와의 상호작용으로 한 극을 잃어버린 매우 불안정한 상태의 산소로 주변의 다른 분자로부터 전자를 끌어와 산화력이 강한 특징이 있다. 이러한 활성산소가 과다하게 발생하면 세포 조직은 손상을 입는다(Hong, 2009). 우리 인체는 체내에 있는 ascornate peroxidase (APX), catalase, glutathione peroxidase (GPX), superoxide dismutase (SOD) 등의 항산화 효소를 이용하거나 항산화제를 섭취하여 활성산소의 균형을 유지하고 있다(Kim et al., 2021). 그러나 다양한 요인에 의해 항산화 효소 생성이 억제되거나 활성산소종이 과다 생성되면 산화적 스트레스가 발생되고, 다양한 질병과 노화의 원인이 된다(Park et al., 2022). 따라서 체내의 항산화 효소 생성을 촉진하거나 활성산소를 억제할 수 있는 천연물 소재에 대한 관심이 높아지고 있다(Park et al., 2022).
DPPH 라디칼은 홀전자를 가지고 있어 항산화제로부터 전자 또는 수소를 공여 받아 라디칼이 소거된다. 보라색을 띠고 있는 라디칼은 환원되어 소거되면서 노란색으로 변하며 흡광도가 감소하게 된다. 이를 이용한 DPPH 분석은 해당 물질의 항산화 효과를 측정하는 대표적인 분석방법 중 하나이다(Yoon et al., 2016).
폴리페놀에는 플라보노이드, 안토시아닌, 탄닌, 카테킨, 레스베라트롤, 아이소플라본 등이 있으며 다수의 하이드록실기(-OH)를 가지고 있어 다른 화합물과 쉽게 결합하기 때문에 항산화, 항암 및 항염 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있다(Kim et al., 2012). 따라서 총 폴리페놀 함량을 이용하여 간접적으로 항산화 효과를 평가하는 지표로 활용하기도 한다(Park et al., 2022).
본 연구에서는 지금까지 목재에 국한되어 연구되어 온 향괴나무(C. platycarpa)를 대상으로 채집 시기 및 부위에 따른 추출물의 항산화효과를 비교하여 새로운 천연소재로서의 활용 가능성을 검토하고, 향후 연구 방향을 제안하고자 한다.
재료 및 방법
식물재료
본 실험에서 사용한 향괴나무는 2023년 5월 27일, 7월 9일, 9월 11일 충북 청주시 충북대학교 수목원 내에서 채집하였다(Fig. 1). 개화기인 5월에는 가지, 잎, 꽃을 7월과 9월에는 각각 잎과 가지를 채집하였다. 채집한 향괴나무는 부위별(잎, 가지, 꽃)로 분리하고 건조기(건국다목적 건조기)에 넣어 38°C의 조건으로 5일간 건조하였다. 건조한 재료는 믹서기(후드믹서, SMX-750BH, (주)모닉스디와이, 대한민국)로 곱게 분쇄하여 추출물 제조를 위한 재료로 활용하였다.
추출물 제조
각 부위별 분쇄 소재를 삼각플라스크에 10 g씩 넣고 두 종류의 용매(증류수, 에탄올)를 각각 200 mL씩 가하여 incubated shaker (진탕배양기, 제이오텍, ISS-4075R, 대한민국)를 이용하여 25°C, 130 ppm으로 24시간 동안 추출하였다. 또한 동결건조 수율을 구하기 위하여 동일한 방법으로 각 부위별 파우더 1 g과 용매 각 20 mL씩 이용하여 추출을 3회 반복하였다. 24시간 후, 깔때기와 거름종이(Whatman No.1)를 이용하여 분쇄 소재를 걸렀다.
동결건조 시료 제조를 위하여 용량이 큰 에탄올 200 mL를 용매로 한 용액은 회전 감압 농축장치(Eyela, JP/CVE3100, Tokyo Rikakikai Co. Japan; Ilshin FD5508 Bondiro Vaccum Freeze Dryer, Korea)를 이용해 2 mL 정도로 농축하였다. 에탄올을 용매로 이용한 경우 동결이 가능하도록 에탄올 농도를 5%이하가 되도록 증류수를 추가하여 조정하였다. 그 후, 모든 용액은 냉동고에 넣어 2주간 얼린 후, 얼린 용액들을 충청북도 산림바이오센터에서 보유하고 있는 동결건조기(ILSHIN FD5508 FREEZE DRYER, 일신, 대한민국)를 이용하여 40°C, 50 mTorr 조건으로 동결건조 하였다.
동결건조 수율 비교
추출물 제조과정 중 동결건조 수율 측정을 위해 동결건조 전후의 시료 무게를 측정하여 다음과 같이 동결건조 수율을 계산하여 시기별, 조직별, 용매별 동결건조 수율을 비교하였다.
DPPH 라디칼 소거능
향괴나무 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 Choi (2014), Kim et al. (2015)을 참고하여 비교하였다. 동결건조한 시료는 용매(증류수, 에탄올)별로 1/50, 1/100, 1/200로 희석하였다. 1.5 mL 튜브에 시료와 대조구(증류수, 에탄올)를 400 μL씩 넣고 0.2 mM DPPH용액을 400 μL씩 처리하였다. 암실에서 30분간 반응 후 96well plate에 시료와 대조구를 250 μL 분주한 후 분광광도계(MOBI, MicroDigital, 대한민국)를 이용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 과정을 3회 반복 후 평균을 구하고, 각 시료의 라디칼 소거능은 다음과 같이 계산하였다.
총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Oh et al. (2008)의 방법을 변형하여 측정하였다. Galic acid를 0.05 ㎎/mL, 0.01 ㎎/mL, 0.005 ㎎/mL, 0.0025 ㎎/mL, 0.001 ㎎/mL의 농도로 만들어 표준물질로 사용하였다. 동결건조 추출물(1/100) 0.5 mL을 2 mL 튜브에 분주하고 2% Na2CO3용액 0.5 mL를 가하였다. 3분간 방치 후 50% Folin-Ciocalteu 시약 0.1 mL를 첨가하여 30분간 암실에서 반응시켰다. 96well plate에 시료와 galic acid를 250 μL씩 분주하고, 분광광도계(MOBI, MicroDigital, 대한민국)로 750 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 과정을 3회 반복 후 평균값을 구하였다. 총 폴리페놀 함량은 gallic acid를 표준물질로 사용한 표준검량곡선을 이용하여 gallic acid equivalents (GAEs)으로 나타내었다.
통계학적 유의성 분석
모든 실험은 3회반복으로 수행하였으며, 각 용매별 농도에 따른 항산화 효과의 유의성을 비교하기 위해 R 4.3.1. (R core Team, https://www.r-project.org)을 사용하여 two-way ANOVA 분석(p<0.05)을 실시하였다. 사후검정은 Tukey test (p < 0.05)를 적용하였다. 총 폴리페놀 함량의 통계학적 유의성은 각 계절별로 비교하였다.
결과 및 고찰
동결건조 수율 비교
향괴나무의 동결건조 수율을 비교한 결과 에탄올을 용매로 이용하여 추출한 경우가 증류수로 추출할 때보다 높은 것으로 확인되었다. 시기 및 조직별 수율을 비교하면 9월에 채집한 잎을 이용한 에탄올 추출물에서 27.496%로 최대값을 가지고, 5월에 채집한 꽃을 이용한 증류수 추출물에서 1.026%에서 최소값을 가지는 것으로 나타났다(Fig. 2, Table 1).
Table 1.
Freeze dry efficiencies (%) of C. platycarpa by collecting time and tissues.
회화나무의 경우, 추출 수율이 괴화는 27%, 괴각은 22%, 괴지는 13%로 보고된 바 있다(Park et al., 2022). 또한 초피나무 동결건조 추출 수율은 잎의 물 추출은 3.54%, 잎 에탄올 추출물은 5.62%, 열매 물 추출물은 10.94%, 열매 에탄올 추출물은 2.77%였다(Choi, 2020). 본 연구결과의 경우 비록 꽃 추출물의 수율이 회화나무와 비교했을 때 상대적으로 낮은 편이지만, 잎이나 가지의 경우 향괴나무의 동결건조 수율은 높은 편으로 판단된다.
DPPH 라디칼 소거능 비교
향괴나무의 라디칼 소거 활성은 증류수 추출물은 5월에 채집한 경우 잎은 1/200 농도에서 78.89%로, 가지는 1/200 농도에서 89.14%, 꽃은 1/100 농도에서 86.67%로 가장 높은 활성을 보였다. 그러나 꽃의 경우 농도에 따른 라디칼 소거 활성의 차이가 없는 것으로 확인되었다. 7월에 채집한 재료의 경우에는 잎은 1/50 농도에서 59.73%, 가지는 1/200 농도에서 73.23%로 가장 높은 소거능을 보였다. 9월에 채집한 잎은 1/200 농도에서 91.63%로 유의한 차이를 보였다. 그러나 가지는 81.94%로 가장 높은 소거능을 보였지만 농도에 따른 차이가 유의하지 않았다. 에탄올 추출물의 경우, 5월에는 잎은 1/50 농도에서 68.61%, 가지는 1/100 농도에서 69.95%, 꽃은 1/50 농도에서 64.87%의 가장 높은 소거능을 보였다. 7월에는 잎은 1/50 농도에서 48.27%, 가지는 1/50 농도에서 61.39%로 가장 높은 소거능을 보였다. 그러나 봄과 여름에 채집한 가지는 1/50 농도와 1/100 농도에서의 차이가 모두 유의하지 않은 것으로 확인되었다. 9월에는 잎과 가지 모두 1/50 농도에서 각각 62.15%와 66.48%로 가장 높은 소거능을 보였다(Fig. 3, Table 2).
Fig. 3.
Comparison of DPPH radical scavenging activities depending on the collecting time and parts of C. platycarpa using the solutions of distilled water (A) and ethanol (B). The p-value is indicated as ‘a, b (a<b)’. If the lower-case letters are different, there was statistical significance in DPPH radical scavenging activities of each sample dissolved by different concentration of distilled water or ethanol. However, results containing the same letters do not show statistical significance (p < 0.05).
Table 2.
Comparison of DPPH radical scavenging activities (%) of C. platycarpa by collecting time and tissues.
식물의 꽃 항산화활성 비교연구에서 등나무 꽃 추출물의 경우, 증류수를 용매로 활용한 경우 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보이는 것으로 알려져 있으며, 실제로 1,000 μg/mL 농도에서 보라색 꽃은 58.21%, 흰색 꽃은 74.52%로 높은 활성을 보였다(Oh et al., 2008). 본 연구 결과, 향괴나무 꽃 추출물의 경우 1/100 농도에서 86.67%로 확인되어 향괴나무의 DPPH 라디칼 소거능이 등나무와 비교하여 더 높은 것으로 나타났다. 회화나무 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 연구결과에서는 괴화, 괴각, 괴지 모두 농도에 비례하여 증가하는 경향을 보이는 것으로 알져져 있으며, 1 ㎎/mL의 농도에서 괴화는 47.06%, 괴각은 69.94%, 괴지는 71.07%의 라디칼 소거능을 확인한 바 있다(Park et al., 2022). 향괴나무의 경우 꽃 추출물이 86.67%, 가지 추출물이 89.14%로 회화나무보다 높은 것으로 확인되어 향괴나무에 항산화 성분이 다량 함유되어 있을 것으로 보인다.
총 폴리페놀 함량 비교
향괴나무의 총 폴리페놀 함량은 7월에 채집한 가지의 에탄올 추출물이 0.511 ㎎ GAE/mL로 가장 높은 함량을 보였고, 5월에 채집한 꽃의 에탄올 추출물이 0.049 ㎎ GAE/mL로 가장 낮게 나타났다. 최대값을 기준으로 총 폴리페놀 함량은 잎보다는 가지의 추출물이 모든 시기에서 더 높은 것으로 확인되었다(Fig. 4, Table 3).
Fig. 4.
Comparison of total polyphenol contents depending on the collecting time and parts of C. platycarpa using the solutions of distilled water and ethanol. The p-value is indicated as ‘a, b (a<b)’. If the lower-case letters are different, there was statistical significance in total polyphenol contents of each sample collected in the same season. However, results containing the same letters do not show statistical significance (p < 0.05) in total polyphenol contents.
Table 3.
Total polyphenol contents (㎎ GAE/mL) of C. platycarpa by collecting time and tissues.
DPPH 라디칼 소거능과 비교하면 5월과 7월에는 DPPH 라디칼 소거능과 총 폴리페놀 함량 모두 가지가 잎보다 높지만 9월에는 잎이 가지보다 DPPH 라디칼 소거능이 더 높은 경향을 보였다. DPPH 라디칼 소거능은 모두 증류수를 용매로 이용하여 추출하는 것이 에탄올 추출보다 높았지만, 총 폴리페놀 함량의 경우 7월 및 9월에 채집한 가지의 에탄올 추출물이 증류수 추출물보다 높은 함량을 보였다. DPPH 라디칼 소거능과 총 폴리페놀 함량 간의 상관관계를 분석한 결과, 매우 약한 양의 상관관계(y = 40.32x + 46.4, R2 = 0.0846)를 보였으나 유의미하다고 판단할 수는 없었다.
회화나무의 추출물에 대한 부위별 총 폴리페놀 함량은 괴화에서 가장 높고 괴각, 괴지 순으로 각각 253.9±3.02 ㎎ GAEs/g, 175.7±2.2 ㎎ GAEs/ g, 90.3±1.9 ㎎ GAEs/g로 보고된 바 있다(Park et al., 2022). 아까시나무의 총 폴리페놀 함량은 꽃 추출물은 14.61 ㎎ GAE/g, 잎 추출물은 37.91 ㎎ GAE/g, 줄기 추출물은 39.65 ㎎ GAE/g로 알져져 있다 (Lee et al., 2012). 본 연구 결과 향괴나무의 총 폴리페놀 함량을 환산하면, 꽃 추출물은 최대 30.07 ㎎ GAE/g, 잎 추출물은 38.83 ㎎ GAE/g, 가지 추출물은 42.98 ㎎ GAE/g로 확인되었다. 따라서 향괴나무는 회화나무에 비해 총 폴리페놀 함량이 낮고, 아까시나무보다는 높은 것으로 나타났다. 식물의 2차 대사산물 중 하나인 폴리페놀은 그 구조적 특징에 의해 항산화능을 간접적으로 확인하는 방법으로 활용되고 있으며, 실제로 회화나무의 연구사례와 같이 총폴리페놀 함량을 이용하여 천연 항산화제로서 활용가능성에 대해 평가하기도 한다 (Kang et al., 2021). 따라서 본 연구결과를 통해 향괴나무가 새로운 천연항산화제로 활용가능할 것으로 판단되며, 향후 꼬리진달래(Kang et al., 2024) 및 덩굴모밀(Choi et al., 2025)의 연구사례와 같이 폴리페놀 프로파일링을 통해 유용 성분의 종류 및 함량을 보다 정밀하게 분석할 필요가 있다.
지금까지 일본산 향괴나무의 목재 조직이 함유하고 있는 다양한 isoflavonone 및 pterocarpan계 물질이 보고된 바 있고(Mizuno et al., 1990; Ohashi et al., 1976, 1977), 국내에 자생하는 다양한 콩과식물을 이용하여 phytoestrogen 활성능력이나 함염 및 항균활성에 대한 연구결과가 다수 보고되어 왔으므로(Bae et al., 2021; Kang et al., 2021; Park et al., 2022) 향후 향괴나무의 추출물을 이용하여 항염, 미백, 탈모방지, 여성용 건강보조제로서의 활용가능성에 대해서도 검증하고자 한다. 특히 미국산 Cladrastis lutea에서도 발견된 Cladastin (Shamma and Stiver, 1969)은 향괴나무 및 그 근연종에서 발견되는 isoflavone 계열의 물질이므로 비록 본 연구에서는 분석하지 못했지만, 앞으로 그 기능에 대해서도 다각도로 확인해 볼 필요가 있을 것으로 판단된다.
적 요
향괴나무는 한국에서는 유일하게 충북대학교 내 수목원에서 자생하는 식물로 지금까지 그 효능에 대해 연구된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 새로운 천연물 소재 발굴을 위해 향괴나무의 항산화 기능을 규명하고자 하였다. 본 연구를 위해 향괴나무를 5월, 7월, 9월에 시기별로 채집하고 잎, 가지, 꽃으로 조직을 나누어 증류수 및 에탄올을 이용하여 추출하였다. 향괴나무 추출물의 동결건조 수율은 에탄올 추출물이 증류수 추출물보다 높은 것으로 나타났으며, 계절별로는 9월, 7월, 5월 순으로 가을에 수확하는 것이 높은 수율을 보임을 확인하였다. 부위별로 비교해보면 잎, 가지, 꽃 추출물의 순으로 수율이 높은 것이 확인되었다. 향괴나무의 DPPH 라디칼 소거능은 9월에 채집한 증류수 용매의 잎 추출물 1/200 농도에서 91.63%로 최대값을 보였고, 에탄올 용매의 가지 추출물 1/200 농도에서 17.67%로 최소값을 나타내었다. DPPH 라디칼 소거능을 용매 별로 비교해보면, 증류수를 이용하여 추출하는 것이 에탄올 추출물보다 높은 항산화 효과를 보이는 것을 확인하였다. 계절별에 따른 차이를 비교하면 7월에 채집하여 건조한 추출물이 5월과 9월에 추출한 것보다 낮은 항산화 효과를 보였다. 부위별로 비교하면, 5월과 7월에는 가지 추출물이 항산화 효과가 크고, 9월에는 잎 추출물이 높은 항산화효과를 보이는 것으로 나타났다. 향괴나무의 총 폴리페놀 함량은 용매 별로 비교하면 7월과 9월에 채집한 가지를 제외하고 증류수로 추출하는 것이 에탄올 추출물보다 항산화 효과가 큰 것으로 나타났다. 계절별로 비교하면 최대값을 기준으로 7월, 9월, 5월 순으로 항산화 효과가 큰 것으로 나타났고, 부위별 비교에서는 가지 추출물의 항산화 효과가 잎과 꽃보다 큰 것으로 나타났다. 본 연구결과를 종합해보면 향괴나무의 DPPH 라디칼 소거능은 17.67-91.63%이고, 총 폴리페놀 함량은 0.120-0.511 ㎎ GAE/mL로 향괴나무의 추출물은 항산화제로서 천연물 소재로 활용될 가능성이 높다고 판단된다.
