서 언
재료 및 방법
공시재료 및 추출 방법
HPLC 분석
반응표면분석 실험 계획
결과 및 고찰
에탄올 농도별 폴리페놀 화합물 함량 분석
반응표면분석법을 이용한 폴리페놀 화합물 함량 분석
덩굴모밀 잎의 최적 추출 조건 예측
적 요
서 언
덩굴모밀은 마디풀과(Polygonaceae)에 속하는 여러해살이풀로 동아시아, 인도, 북미지역에 분포하며 우리나라에서는 제주도 해안가에 제한적으로 자생하며 산림청 지정 희귀식물로 세계자연보전연맹(IUCN)이 지정한 취약종(VU)이다(Korea National Arboretum, 2021). 또한 덩굴모밀은 항박테리아, 항균, 항염 활성을 가져 의약, 화장품, 건강기능식품 소재로 이용 가능성이 높다(Hossen et al., 2015; Lai et al., 2012).
식물의 대표적인 이차 대사산물인 폴리페놀 화합물은 항산화 효과가 우수하고 인공 화합물에 비해 적은 부작용을 가져 산업화의 지표 물질로 이용되고 있다(Tapsell et al., 2006). 최근 덩굴모밀의 이용을 위해 폴리페놀 화합물 분석 연구가 수행되었으며(Chen et al., 2020; Yang et al., 2024), 덩굴모밀에서 확인되는 폴리페놀 화합물 중 neochlorogenic acid, corilagin, geraniin, ellagic acid이 잎에서 높은 함량을 가진다고 보고되었다(Choi et al., 2025). Neochlorogenic acid는 항암 예방 및 치료에 효과가 있다고 보고되었으며(Kurita et al., 2016), corilagin과 geraniin은 간 보호, 항암 등의 약리활성이(Li et al., 2018; Perera et al., 2015), ellagic acid는 항염증과 신경 보호 효능 등이 보고되었다(Ríos et al., 2018). 덩굴모밀 추출물은 면역과민 완화 효능과 관련된 특허 출원이나 자생지 및 추출 조건에 따른 총 폴리페놀 함량 비교와 같이 자원화를 위한 여러 시도가 있었으나(Cho et al., 2024; Luo et al., 2024) 아직까지 자원화를 위해 필요한 지표 물질의 추출 최적화에 관한 연구는 부족한 실정이다.
식물의 이차 대사산물은 추출 조건에 따라 함량 변화가 크기 때문에 최적의 추출 조건 구명하기 위해 많은 시간과 비용이 소요된다(Baharuddin et al., 2021). 반응표면분석법은 이런 문제를 해결하기 위한 분석법 중 하나로, 독립변수에 대한 종속변수의 영향과 관계를 분석하여 최적 조건을 예측하는데 주로 이용된다(Breig and Luti, 2021; Park et al., 2011). 또한 적은 실험 횟수로 최대의 정보를 얻을 수 있고(Myers, 1971), 변수에 따른 결과값을 분석하여 유의한 요인 효과들을 도출하여 시간 절감과 요인별 상호작용도 관찰할 수 있어 최적 조건을 구하는데 유용하게 사용된다(Zhu et al., 2010). 최근 반응표면분석법은 식물의 자원화를 위한 수확물 전처리, 추출 최적화 등에도 유용하게 이용되고 있으며(Choi et al., 2024; Kim et al., 2023; Lim et al., 2024), 실험 설계 방법으로는 Factorial design, Box-Behnken design, Central composite design 등이 있다. 이 중 Box-Behnken design (BBD)은 예측 모델 제작에 필요한 최소 실험 횟수가 적어 산업 연구에 널리 사용되고 있다(Breig and Luti, 2021). 이에 본 연구에서는 식물 추출에 적합하고 추출 성분 분석의 기준이 되며 산업화 초기 단계에서 가장 기초적인 추출법으로 활용되는 침지 추출법을 적용하여(Azwanida, 2015), 희귀식물인 덩굴모밀의 자원화를 위한 연구를 수행하였다. 반응표면분석법을 이용하여 지표 물질로 이용 가능성이 높은 4종의 폴리페놀 화합물에 대한 최적 추출 조건을 구명하고자 하였으며 이를 통해 추출 효율 증진에 대한 정보를 제공하고자 하였다.
재료 및 방법
공시재료 및 추출 방법
본 연구에서 사용된 시료는 국립세종수목원 온실 내에 재배 중인 덩굴모밀의 잎을 2024년 12월에 채취하여 사용하였으며(관리번호 : SJNA2020-002103-001), 덩굴모밀 종 동정은 국립세종수목원 김혜원 연구원이 하였다. 채취한 잎은 수세하여 이물질을 제거하고 48시간 동안 40℃에서 열풍건조 후 분쇄하여 실험에 이용하였다. 반응표면분석 변수 설정을 위해 건조된 덩굴모밀 잎을 1:50 (w/v) 비율로 6단계(0, 20, 40, 60, 80, 100%)의 농도별 항온수조를(NB-301L, NBIOTEK, Bucheon, Korea) 이용하여 에탄올에 60℃ 온도에서 24시간 동안 침지 추출한 후 4,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 분석하였다. 이후 Box-Behnken design (BBD)에 따라 건조된 덩굴모밀 잎을 1:50 (w/v) 비율로 0, 40, 80% 에탄올에 25, 50, 75℃ 온도에서 6, 18, 30시간 동안 항온수조를 이용하여 침지 추출한 후 4,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 분석하여 반응표면분석을 수행하였다.
HPLC 분석
덩굴모밀 잎의 폴리페놀 화합물 중 높은 함량이 함유되어 있다고 보고되어(Choi et al., 2025) 지표 물질로 이용 가능성이 있는 4종(neochlorogenic acid, corilagin, geraniin, ellagic acid)의 함량을 측정하기 위해 덩굴모밀 잎 추출물과 메탄올에 용해한 표준물질을 0.45 ㎛ PVDF syringe filter (HENKE- JECT, Tuttlingen, Germany)로 여과하여 분석에 사용하였다. Thermo Ultimate 3000 (Thermo scientific, MA, USA)과 Hypersil GOLD C18 (250 × 4.6 ㎜, 5 ㎛, Thermo scientific, MA, USA)을 이용하여 컬럼온도 45℃, 유속은 0.5 mL/min, 시료 주입량은 10 μL로 하여 검출파장 280 ㎚에서 분석하였으며, 분석조건은 Table 1과 같다. 모든 용매는 사용 전 탈기 및 여과하였다. 시료의 검출시간(retention time, RT)을 표준물질의 스펙트럼과 비교하여 정성 평가를 수행하였으며 덩굴모밀 추출물의 피크 면적을 기준으로 표준물질의 검량선을 이용하여 정량 분석하였다.
Table 1.
Analytical conditions of HPLC for analysis of polyphenol compound.
| Time (min) | Gradient profile | |
|
Mobile phase Az (%) |
Mobile phase By (%) | |
| 0 | 97 | 3 |
| 0.5 | 97 | 3 |
| 15 | 87 | 13 |
| 55 | 87 | 13 |
| 55.1 | 97 | 3 |
| 60 | 97 | 3 |
반응표면분석 실험 계획
덩굴모밀 잎의 폴리페놀 화합물 추출 조건 최적화를 위한 반응표면분석은 BBD에 따라 3가지 독립변수(X1: 에탄올 농도, X2: 추출 시간, X3: 추출 온도)를 설정하여 3반복 실험하였다. BBD에 따라 중심점 5개를 포함하는 총 17개 구간을 설정하고 랜덤화하여 실험을 수행하였으며, 종속변수로는 neochlorogenic acid, corilagin, geraniin, ellagic acid의 함량을 선정하였다(Table 2). BBD를 통해 얻어진 결과는 R program (Ver 4.2.2) ‘rsm’ package를 이용하여 회귀분석에 의한 모델식을 예측하였다. 예측값과 실험값의 유의적 차이를 검증하기 위해 One-Sample t-test로 분석하였다.
Table 2.
Experimental design and response of the dependent variables to extraction conditions.
결과 및 고찰
에탄올 농도별 폴리페놀 화합물 함량 분석
반응표면분석을 이용하여 식물의 추출물을 분석할 때, 적절한 독립변수의 범위를 설정하는 것은 중요하다(Rohilla and Mahanta, 2021). 예비실험을 통해 독립변수에 따른 결과 값의 변화가 가장 큰 에탄올 농도의 변수 범위 설정을 위해 0, 20, 40, 60, 80, 100% 농도별 폴리페놀 화합물의 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같다. Neochlorogenic acid, corilagin, geraniin의 함량은 40% 에탄올 추출물에서 각각 6.82±0.21 ㎎/g, 3.82± 0.15 ㎎/g, 4.43±0.16 ㎎/g으로 가장 높았으며, ellagic acid는 60% 에탄올 추출물에서 4.35±0.16 ㎎/g으로 가장 높았다. 모든 물질의 함량 변화는 일정 에탄올 농도까지 증가하였다가 이후 감소하는 이차곡선 형태의 양상을 보여 에탄올 농도는 이차모형을 가정하는 반응표면분석법의 독립변수로 적합한 것으로 판단되었다(Park, 2022). 또한 100% 에탄올 추출물에서는 폴리페놀 화합물의 함량이 크게 감소하여 너무 높은 에탄올 농도에서는 오히려 추출 효율이 감소할 수 있다는 보고와 유사한 결과를 보였다(Choi et al., 2023). 따라서 에탄올 농도 독립변수는 0%와 80% 사이의 농도가 반응표면분석을 위한 적절 범위 판단되어 BBD의 에탄올 농도 범위로 설정될 수 있음이 확인되었다.
Table 3.
Changes in content according to the extraction concentration of polyphenol compound.
|
EtOH conc. (%) | Experimental values | |||
|
Neochlorogenic acid (㎎/g) |
Corilagin (㎎/g) |
Geraniin (㎎/g) |
Ellagic acid (㎎/g) | |
| 0 | 5.98±0.41az | 3.48±0.05ab | 1.17±0.03d | 0.36±0.02a |
| 20 | 6.29±0.22a | 3.81±0.12a | 3.45±0.11b | 1.82±0.05c |
| 40 | 6.82±0.21a | 3.82±0.15a | 4.43±0.16a | 3.37±0.13d |
| 60 | 4.29±0.24b | 3.53±0.12ab | 3.34±0.16b | 4.35±0.16e |
| 80 | 3.47±0.37b | 2.54±0.19b | 1.68±0.07c | 4.20±0.47e |
| 100 | 1.84±0.15c | 0.54±0.01c | 0.66±0.03e | 0.96±0.22b |
반응표면분석법을 이용한 폴리페놀 화합물 함량 분석
BBD에 의해 설정된 17개 구간의 추출 조건을 설정하였고, 이에 따른 덩굴모밀 잎 추출물의 폴리페놀 화합물 함량에 대한 반응표면분석 결과는 Fig. 1, 2와 같다. Geraniin은 실험 조건 내에서 최대값을 보이는 정상점(Stationary point)이 확인되었으나 다른 물질들은 정상점이 확인되지 않았다. 일반적으로 식물 추출 과정에서는 추출 시간, 추출 온도 등의 변수 간 상호작용이 미미한 경우 단순한 형태의 반응표면이 나타날 수 있으나(On-Nom et al., 2024) 변수에 따른 반응표면의 변화 양상을 분석하여 산업적 이용을 위한 조건별 예상 결과를 도출하는 것은 중요하다(Palanikumar, 2021). Neochlorogenic acid는 추출 시간(X2)과 추출 온도(X3)가 증가할수록 함량이 증가하고 에탄올 농도(X1)가 증가할수록 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 독립변수 회귀방정식의 R2값은 0.981로 1에 가까운 값을 나타내어 반응모형을 신뢰할 수 있음을 확인하였다(Table 4). 또한 ANOVA를 수행하였을 때, 교차항을 제외한 모든 항과 예측 모델의 F-value가 15 이상으로 높고, p-value가 0.01 이하로 낮은 결과 값을 보여 유의성이 확인되었으며, Lack of fit값은 0.16으로 예측 모델은 적합한 것으로 판단되었다. 변수 중 에탄올 농도 일차항(X1)의 F-value가 가장 높아 예측 모델에 영향이 가장 컸으며, X1, X2, X3과 X12항이 p-value가 0.01 이하로 유의성이 확인되었다(Table 5). Corilagin은 추출 온도(X3)에 따른 함량 변화가 가장 큰 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 독립변수 회귀방정식의 R2값은 0.987로 높았으며, 모든 항의 p-value가 0.01 이하로 낮은 결과 값을 보이고 교차항을 제외한 모든 항의 F-value가 15이상으로 높아 유의성이 있는 것으로 판단되었다. 또한 변수 중 X32항의 영향력이 가장 컸으며(F-value = 340.05), X2, X3, X23, X32항의 유의성이 확인되었다(Table 4, 5). Corilagin의 Lack of fit값은 0.01 이하로 낮았으나 적합결여 검정을 보완하는 방법으로 이용되는 모형 적합비율(MFP, Model-Fit Propartion)과 순수오차 변동계수(CPEV, Coefficient of Pure Error Variation)의 값이 각각 0.9867, 6.09%로 예측 모델이 적합함을 확인하였다. 모형 적합비율은 최대 1의 값을 가지며 값이 클수록, 최소 0의 값을 가지는 순수오차 변동계수는 값이 작을수록 모형이 적합함을 의미한다(Rheem and Rheem, 2012).
Table 4.
Optimalized response polynomial equations fitted in quadratic model for polyphenol compound.
Table 5.
Analysis of variance for neochlorogenic acid, corilagin.
Geraniin은 에탄올 농도 41.5%, 추출 시간 16.6시간, 추출 온도 51.4℃에서 5.84 ㎎/g을 최대값으로 하는 정상점이 확인되었다(Fig. 2). 추출 온도(X3)가 증가함에 따라 geraniin의 함량이 증가하였다가 일정 온도 이후 감소하는 양상은 Yang et al. (2010)의 보고와 유사하여 추출 온도는 geraniin 추출에 영향을 주는 주요 변수로 판단된다. 독립변수 회귀방정식의 R2값은 0.993으로 높았으며, 일차항을 제외한 모든항의 F-value가 10 이상이었으며, X12항의 영향력이 가장 높았다(F-value = 507.06). 또한 예측 모델 p-value가 0.01 이하로 낮았으며, 변수 중 X23, X12, X22, X32항의 p-value가 0.01 이하로 유의성이 있다고 판단되었다(Table 6). Lack of fit값은 0.04로 적합결여 기준인 0.05보다 낮았으나 모델 적합비율과 순수오차 변동계수의 값이 각각 0.9937, 4.74%로 예측 모델이 적합함을 확인하였다. Ellagic acid는 모든 독립변수가 증가할수록 함량이 증가하는 양상을 보였으며, 독립변수 회귀방정식의 R2값은 0.986으로 높았으며, 모든 항의 F-value가 10 이상이었으며, 변수 중 X3항의 영향력이 가장 컸다(F-value = 285.24), 또한 예측 모델과 변수 중 대부분의 p-value가 0.01 이하로 낮아 유의성이 있다고 판단되었다(Table 6). Lack of fit값은 0.01 이하 낮았으나 모델 적합비율과 순수오차 변동계수의 값이 각각 0.9864, 4.63%로 예측 모델이 적합함을 확인하였다.
Table 6.
Analysis of variance for geraniin, ellagic acid.
덩굴모밀 잎의 최적 추출 조건 예측
덩굴모밀 잎에서 반응표면분석을 통하여 도출된 폴리페놀 화합물의 최적 추출 조건과 예측값, 실험값은 Table 7과 같다. Neochlorogenic acid의 최적 추출 조건은 에탄올 농도 19.2%, 추출 시간 27.1 시간, 추출 온도 75℃였다. 최적 추출 조건에서 예상된 neochlorogenic acid의 값은 5.90 ㎎/g였으며, 실제 실험값은 5.82±0.25 ㎎/g으로 95% 신뢰구간에서 통계적으로 유의한 차이가 없었다. Corilagin의 최적 추출 조건은 에탄올 농도 0%, 추출 시간 30 시간, 추출 온도 75℃로 예측값은 5.64 ㎎/g이었으나 실험값은 4.40±0.14 ㎎/g으로 예측값과 실험값이 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p < 0.01). BBD를 통한 실험 설계의 경우 변수 요인의 가장자리에서 최적값이 예상될 때, 실험값과 예측값의 차이가 발생하는 등 여러 오차의 발생 가능성이 있으나 이에 대한 해석을 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다(Kim and Lee, 2012).
Table 7.
Predicted and experimental values using optimal conditions for polyphenol compound.
Geraniin 최적 추출 조건은 에탄올 농도 41.5%, 추출 시간 16.6 시간, 추출 온도 51.4℃였다. 최적 추출 조건에서 예상된 geraniin의 값은 5.84 ㎎/g이었으며, 실제 실험값은 5.95± 0.44 ㎎/g으로 95% 신뢰구간에서 통계적으로 유의한 차이가 없었다. Ellagic acid 최적 추출 조건은 에탄올 농도 80%, 추출 시간 30 시간, 추출 온도 75℃였다. 최적 추출 조건에서 예상된 ellagic acid의 값은 5.67 ㎎/g이었으며, 실제 실험값은 7.45± 1.25 ㎎/g으로 예측값에 비해 실험값이 높았으나 corilagin과 유사하게 예측 모델의 모든 변수 요인의 가장자리에서 최적값이 예상되어 실험값과 예측값의 차이가 발생한 것으로 판단된다(Kim and Lee, 2012). 또한 실험값과 예측값의 차이가 비교적 적어 99% 신뢰구간에서 통계적으로 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다. Platycarya strobilacea의 경우, ellagic acid의 최적 추출 조건의 온도는 70℃로 보고되었으며(Zhang et al., 2010), Terminalia chebula에 함유된 ellagic acid의 최적 추출 조건은 온도 77℃, 에탄올 농도 61%로 보고되어(Wu et al., 2024), ellagic acid는 고온의 추출 조건에서 높은 추출 효율을 갖는 것으로 사료된다. Luo et al. (2024)는 덩굴모밀에 함유된 rutin의 추출 효율이 70% 에탄올에서 가장 높다고 보고하였으나 본 연구에서는 물질에 따른 최적 추출 농도가 상이한 것으로 나타났다. 이에 따라 추출 대상 물질에 따라 추출 조건을 달리 적용할 필요가 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 반응표면분석법을 이용하여 덩굴모밀 잎의 최적 추출 조건을 확인하였으며, 효율적인 자원 이용을 위해 전처리 조건 구명 등 세부적인 추출 조건 탐색을 통한 추출 효율 증진 등의 후속 연구가 필요할 것으로 예상된다.
적 요
본 연구는 자원식물로 개발 중인 덩굴모밀을 이용하여 잎에서 함량이 높고 유용성이 알려져 지표성분으로 선발될 가능성이 높은 4종의 폴리페놀 화합물(neochlorogenic acid, corilagin, geraniin, ellagic acid)의 효율적인 확보를 위해 반응표면분석을 이용하여 최적 추출 조건을 확인하고자 수행되었다. 열풍 건조된 덩굴모밀 잎을 Box-Behnken design (BBD)에 따라 3가지 독립변수(에탄올 농도, 추출 시간, 추출 온도)를 설정하여 17개 구간에 대해 실험을 수행하였으며, 종속변수로는 neochlorogenic acid, corilagin, geraniin, ellagic acid의 함량을 측정하였다. Neochlorogenic acid의 최적 추출 조건은 에탄올 농도 19.2%, 추출 시간 27.1 시간, 추출 온도 75℃였다. 예측값은 5.90 ㎎/g이었으며 실험값은 5.82±0.25 ㎎/g으로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. Corilagin은 예측값과 실험값이 통계적으로 유의한 차이를 보였으며, geraniin 최적 추출 조건은 에탄올 농도 41.5%, 추출 시간 16.6 시간, 추출 온도 51.4℃였다. 예측값은 5.84 ㎎/g이었으며, 실험값은 5.95±0.44 ㎎/g으로 95% 신뢰구간에서 통계적으로 유의한 차이가 없었다. Ellagic acid 최적 추출 조건은 에탄올 농도 80%, 추출 시간 30 시간, 추출 온도 75℃였으며, 예측의 값은 5.67 ㎎/g, 실험값은 7.45±1.25 ㎎/g으로 예측값에 비해 실험값이 높았으나 99% 신뢰구간에서 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 반응표면분석법으로 도출된 최적 추출 조건을 통해 덩굴모밀 잎에서 폴리페놀 화합물의 효율적인 확보가 가능함을 확인하였다.
