서 언

알레르기성 염증질환은 항원 및 외부물질에 과민하게 반응하는 면역체계 이상증상이 원인으로 보고되어 있다(Yao and Narumiya, 2019). 최근 미세먼지 증가, 대기오염 서구식 식생활 변화 및 스트레스 증가 등의 다양한 원인으로 알레르기성 염증 질환이 증가하는 추세이다. 비만세포(mast cell)는 FcεRI 수용체를 지닌 면역세포로 즉시형 과민반응에 관여하는 세포로 알려져 있다(Kee and Hong, 2019). 병원균 및 항원에 의한 면역체계 이상으로 IgE의 비정상적인 생성 증가는 비만세포 수용체인 FcεRI과 결합하여 비만세포의 탈과립 과정을 유도한다. 비만세포 내에 저장되어 있는 매개물질로는 histamine, proteases, leukotrienes, prostaglandins과 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin (IL)-1, IL-6, 및 IL-8와 같은 cytokine을 포함한다(Jemima et al., 2014). 비만세포의 탈과립 물질은 혈장유출, 조직부종, 기관지수축, 백혈구 증가, 점막염증 등을 유도하여 알레르기성 염증반응을 악화시킨다(Caughey, 2016).

세포 내 활성산소(reactive oxygen species, ROS)는 세포 내 지질, 단백질, DNA를 손상시킴으로써 염증, 자가면역질환, 암 등 다양한 질병을 일으키는 원인으로 알려져 있다(Addor et al., 2017). 산화스트레스(oxidative stress)와 염증은 밀접한 연관성이 있으며, 염증성 질환에서 활성산소 증가는 염증세포의 유입을 증가시키고 이로 산화성 조직손상을 더 악화시킨다(Godic et al., 2014). 따라서 항산화제는 다양한 알레르기 염증 질환의 예방 및 치료에 중요한 역할을 한다.

Nuclear factor-kappa B (NF-κB)는 다양한 염증인자들과 성장인자의 합성을 조절하는 전사인자로 암, 염증 등 다양한 질환의 병변을 조절한다(Gilmore, 2006; Kim, 2023; Lappas et al., 2002). 비활성상태의 NF-κB는 IκB-α와 결합한 상태로 세포질에 존재하는데, 외부자극에 의해 IκB-α의 인산화 및 분해되면서 NF-κB는 유리되어 핵 내로 이동한다(Birrell et al., 2005). 활성화된 NF-κB는 전사인자로서 작용하여 염증매개 인자의 발현을 증가시켜 알레르기성 염증질환을 유도한다. Caspase-1은 효소원 형태로 존재하는 caspase계열의 한 종류로, 염증성 신호전달 경로를 활성화하는 염증 개시자로 알려져 있다(Lee et al., 2001). 최근 연구결과, 활성화된 caspase-1은 염증성 사이토카인 생성 및 염증 세포 유입을 증가시켜 염증 반응을 악화시키는 것으로 보고되고 있다(Han et al., 2017). NF-κB및 caspase-1신호 전달 경로 억제는 알레르기 염증 치료를 위한 중요한 타겟으로 알려져 있다.

한련초(Eclipta prostrata L.)는 국화과(Asteraceae)에 속하는 다년생 초본 식물로, 항산화, 혈당감소, 항균, 항암, 간기능 개선 등의 다양한 약리 효능이 보고되어 있다(Reiber et al., 1998; Singh et al., 1993). 한련초는 saponin, nicotine, tannin, wedelolactone 등 유효성분이 함유되어 있다. 지금까지 한련초의 비만세포 매개의 알레르기 염증 조절 효과 및 기전 규명연구가 미비한 실정이다. 본 연구에서는 활성화된 비만세포에서 한련초의 히스타민, 염증성 사이토카인 생성 및 NF-κB와 caspase-1 활성화에 미치는 영향을 연구하였다.

재료 및 방법

재료

Gallic acid, calcium Ionophore A23187, potassium persulfate, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH), Folin-Ciocalteu phenol reagent, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid (ABTS), avidin peroxidase (AP) 및 그 외 다른 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) 와 Fetal bovine serum (FBS)는 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. Anti- human IL-8, TNF-α 및 IL-6 ELISA kit 는 BD Biosciences (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. Caspase-1 assay kit 는 R&D System Inc (MN, USA)에서 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) assay kit는 Promega (WI, USA)에서 구입하였다. NF-κB antibodies 는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다. Bicinchoninic acid (BCA), nuclear extraction kit, 및 enhanced chemiluminesence (ECL)는 Pierce Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.

시료추출

본 실험에서 사용된 한련초는 대학한약국(Iksan, Korea)에서 구입하였다. 한련초 100 g을 세척 후, 70% 에탄올 1 L를 가하여 초음파 3회 후 추출하였다. 추출 완료 후 Whatman (No. 1) filter paper로 여과하였고, 이를 rotary evaporator (Hahnshin S&T Co., Gyeonggi-do, Korea)로 감압 농축하였다. 이후 추출물을 동결 건조기(Eyela, Japan)에서 얻어진 시료는 –20℃에 보관하였다 (수득률: 9.78%).

DPPH radical 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능은 Brand-Williams et al. (1995)과 Katalinic et al. (2006)의 방법을 변형하여 측정하였다. 한련초 추출물(0.1, 0.5, 1, 2 ㎎/mL)의 100 μL와 150 μM DPPH 용액 100 μL와 동량으로 혼합하여 반응시켰다. 30분 암반응 후, 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS radical 소거능 측정

ABTS 양이온 라디칼 소거능은 Re et al. (1999)의 방법에 따라 측정하였다. 실험용 ABTS+ 용액은 7 mM ABTS와 2.45 mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 증류수에 혼합한 후, 실온에서 16시간 반응시켜 ABTS 양이온을 생성하였다. 생성된 용액은 734 ㎚에서 흡광도 값이 0.7±0.03이 되도록 희석하여 사용하였다. 한련초 추출물(0.01, 0.1, 1 ㎎/mL) 100 μL와 ABTS+ 용액 100 μL동량으로 반응시킨 후 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약을 사용하여 평가하였다. 한련초 추출물 1 mL를 시험관에 넣고 Folin-Ciocalteu 시약 1 mL를 첨가하여 5분간 반응시켰다. 이후 10% 탄산나트륨(Na₂CO₃) 용액 5 mL를 첨가하여 혼합한 뒤, 암조건에서 30분간 반응 시킨 후 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 Gallic acid (GA)를 이용한 검정선에 의해 계산하였고, ㎎ GAE/g 단위로 나타내었다.

세포 배양

비만 세포주인 HMC-1 (Human mast cell-1)는 10% FBS와 100 U/mL penicillin/streptomycin이 이 함유된 IMDM 배지에서 온도 37℃, 5% CO₂ 조건의 세포 배양기에서 배양하였다. 본 실험에서는 50 nM의 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)와 1 ㎎/mL의 calcium ionophore A23187 (PMACI)를 처리하여 세포활성을 유도하였다.

세포 생존율 측정

한련초 추출물의 세포독성 효과를 측정하기 위하여 MTS 분석을 수행하였다 세포에 다양한 농도(0.01, 0.1, 1 ㎎/mL)의 한련초 추출물을 처리 후 24시간동안 배양하였다. 이후 MTS 용액 30 uL을 각 well에 첨가하여 1시간 이후 490 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 평가하였다.

Enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay

세포(3 × 10⁵ cells/well)를 다양한 농도(0.01, 0.1, 1 ㎎/mL)의 한련초 추출물을 30분 전처리 후 PMACI로 자극하고 8시간 배양하였다. 세포에서 분비되는 사이토카인 함량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 96 well plates에 anti-human IL-6, IL-8, TNF-α 단일클론 1차 항체로 코팅한 후, 4°C에서 24시간 동안 반응시켰다. 세척 후, 시료 또는 IL-6, IL-8, TNF-α 의 재조합 단백질 표준물질을 37°C에서 2시간 반응시켰다. 다시 세척한 후, biotin가 처리된 anti-human IL-6, IL-8, TNF-α 2차 항체로 1시간 반응시켰다. 이후 AP를 첨가하여 microplate reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

Histamine assay

비만세포에서 분비된 히스타민의 양은 histamine assay kits (Neogen, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 간단히 요약하면 항체가 코팅된 well에 반응액과 시료 혼합액 100 µL을 넣고 10분 반응시켰다. 세척 후, 기질 100 µL를 각 well에 첨가하여 10분 반응시켰다. 이후 stop용액 100 µL를 첨가하고, 650㎚에서 흡광도를 측정하였다.

Western blot analysis

핵내 NF-κB의 활성측정을 위하여 nuclear extraction kit를 이용하여 세포에서 핵단백질을 분리하고 BCA assay kit를 이용해 단백질 농도를 정량하였다. 20 µg의 lysate를 10% SDS-PAGE gel로 변성 분리하여 이를 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane에 transfer하였다. Membranes은 5% skim milk에 2시간 동안 blocking하고 1차 항체를 4°C, overnight으로 반응시켰다. 이후 PBST로 세척 후, 2차 항체에 1시간 동안 반응시키고 ECL를 활용하여 단백질 발현량을 측정하였다.

Caspase-1 activity 측정

Caspase-1 활성은 caspase-1 colorimetric kit(R&D System Inc., MN, USA)를 사용하여 측정하였다. 단백질 정량 후, 시료에 반응액 50 μL와 caspase-1 기질 5 μL를 첨가한 뒤, 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 405 ㎚에서 흡광도를 측정하여 caspase-1 활성을 분석하였다.

통계처리

실험 결과 값은 평균 ± 표준편차(S.D)로 나타내었고, 통계 프로그램 SPSS을 이용해 일원분산분석(one-way ANOVA) 후, 그룹 평균 간의 차이를 검정하기 위해 Duncan을 통해 사후분석을 실시하였다. 실험 결과의 통계학적 유의성 검증 수준은 P < 0.5로 표기하였다.

결 과

한련초 추출물의 항산화 효능

항산화 효능이 뛰어난 물질은 다양한 알레르기 염증 질환의 예방에 중요한 역할을 한다. 한련초 추출물의 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH 라디칼 소거 활성과 ABTS⁺ 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 실험결과, 한련초 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 및 ABTS⁺ 라디칼을 소거하는 활성을 나타냈다. DPPH 라디칼 소거능은 0.01 ㎎/mL에서 24.1%, 0.1 ㎎/mL에서 44.5%, 1 ㎎/mL에서 77.2%였다(Fig. 1A). 양성대조군 (Vit C)의 DPPH 라디칼 소거능은 90.2%로 확인되었다. ABTS⁺ 라디칼 소거능은 0.01 ㎎/mL에서 32.7%, 0.1 ㎎/mL에서 48.9%, 1 ㎎/mL에서 76.2%로 확인되었고, 양성대조군 (Vit C)의 ABTS⁺ 라디칼 소거능은 92.3%로 확인되었다 (Fig. 1B).

Fig. 1.

Anti-oxidative activity of EP. (A) DPPH free radical scavenging activity. (B) ABTS free radical scavenging activity. (C) Total polyphenolics contents. The data represents the mean ± S.D. of three independent experiments (^*P < 0.5 vs. control group).

천연물의 항산화 활성은 일반적으로 총 폴리페놀 함량과 밀접한 관련이 있다. 이에 본 연구에서는 한련초 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정결과, 1 ㎎/mL 시료에서 77.3 ㎎ GAE/g의 총 폴리페놀 함량이 확인되었다(Fig. 1C).

한련초 추출물의 세포독성 및 히스타민 생성 조절 효과

비만세포에서 한련초 추출물의 세포의 생존에 미치는 영향을 측정하기 위해 다양한 농도(0.01, 0.1, 1 ㎎/mL)의 한련초 추출물을 세포에 24시간 처리 후 MTS 분석법을 수행하였다. 실험 결과, 다양한 농도(0.01, 0.1, 1 ㎎/mL)의 한련초 추출물에서 95% 이상의 세포 생존율을 확인하였다(Fig. 2A). 이는 실험에 사용된 농도에서 한련초 추출물이 세포독성을 나타내지 않음을 나타낸다.

Fig. 2.

Effects of EP on cell viability and histamine release in activated- HMC-1 cells. (treated with various concentrations of EP (0.01, 0.1 and 1 ㎎/ mL) for 24 h and cell viability was measured using the MTS assay. (B) Cells were pretreated with various concentration of EP (0.01, 0.1 and 1 ㎎/mL) for 30 min and stimulated with PMA (50 nM) + A23187 (1 ㎎/mL) for 3 h. The amount of histamine was measured by histamine assay kit. Results are shown the mean ± SD of experiments. ^#, P < 0.5; significantly different from control, ^*, P< 0.5; significantly different from PMACI alone.

비만세포에서 유래된 히스타민은 알레르기성 염증을 유도하는 주요 인자이며, 히스타민 억제는 알레르기성 염증 치료에 도움이 될 수 있다(Caughey, 2016). 본 연구에서는 PMACI에 의해 활성화된 비만세포에서 한련초 추출물의 히스타민 생성에 대한 조절 효과를 측정하였다. 다양한 농도(0.01, 0.1, 1 ㎎/mL)의 한련초 추출물을 처리 후, PMACI로 3시간 자극하고 히스타민 생성량을 측정하였다. Fig. 2B에서 볼 수 있듯이, 무처리군에 비해 PMACI처리군에서는 히스타민 생성량이 유의적으로 증가하였고, 반면 한련초 추출물군에서는 농도 의존적으로 히스타민 분비를 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 2B). 특히, 1 ㎎/mL 농도의 한련초 추출물은 약 38.8%의 최대 억제 효과(P < 0.5)를 보였다.

한련초 추출물의 염증성 사이토카인 생성 조절 효과

염증성 사이토카인 생성 증가는 알레르기 염증질환에서 임상적 변화의 주요한 특징이다. 본 연구에서는 한련초 추출물의 항염증 효과를 측정하기 위하여 활성화된 비만세포에서 염증성 사이토카인 조절 효과를 측정하였다. 다양한 농도(0.01, 0.1, 1 ㎎/mL)의 한련초 추출물을 전처리 후, PMACI로 8시간 자극하였다. 이후, 세포에서 분비 된 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 생성량을 ELISA 방법으로 측정하였다. Fig. 3에서 볼 수 있듯이 무처리군에 비해 PMACI 처리군에서는 IL-6 IL-8 및 TNF-α의 생성량이 유의적으로 증가하였다. 그러나 한련초 추출물군에서는 PMACI로 증가된 IL-6, IL-8 및 TNF-α 생성량을 농도 의존적으로 억제하였다. 특히 고농도(1 ㎎/mL)의 한련초 추출물군에서 IL-6의 경우 약 35.1%, IL-8의 경우 약 32.8% 및 TNF-α의 경우 약 37.5%의 억제효과를 확인하였다

Fig. 3.

Effects of EP on inflammatory cytokines secretion in activated- HMC-1 cells. Cells were pretreated with various concentration of EP (0.01, 0.1 and 1 ㎎/ mL) for 30 min and stimulated with PMA (50 nM) + A23187 (1 ㎎/mL) for 8 h. The amounts of TNF-α, IL-6 and IL-8 were measured by ELISA kits. Results are shown the mean ± SD of experiments. ^#P < 0.5; significantly different from control, ^*P< 0.5; significantly different from PMACI alone.

한련초 추출물의 NF-kB /caspase-1 활성 조절 효과

NF-κB는 염증성 매개인자의 발현을 조절하는 대표적인 전사인자로 알레르기 염증병변 악화와 연관성이 있는 것으로 보고되고 있다. 활성화된 NF-κB는 핵 내로 이동하여 염증성 사이토카인 발현을 유도한다. 본 연구에서는 한련초 추출물의 항염증 기전을 규명하기 위하여 활성화된 비만세포에서 NF-κB의 핵내 이동 변화를 측정하였다. 다양한 농도의 한련초 추출물(0.01, 0.1, 1 ㎎/mL)을 처리하고 PMACI를 2시간 자극하였다. 이후 핵단백질을 분리하여 NF-κB 활성변화를 Western blot 방법으로 측정하였다. 실험결과, 무처리군에 비해 PMACI처리군에서는 핵 내의NF-κB 발현이 증가하였고, 반면 한련초 추출물군에서는 PMACI로 증가된 NF-κB 핵내의 이동이 억제하였다(Fig. 4A). 한련초 추출물의 NF-κB 억제 효과를 측정한 결과, 고농도(1 ㎎/mL)의 한련초 추출물군에서 NF-κB의 핵내의 발현이 약 39.5% 억제하였다. Fig. 4B는 NF-κBB의 상대적 발현량을 나타내었다.

Fig. 4.

Effect of EP on NF-κB/caspase-1 activation in activated- HMC-1 cells. (A) Cells (6 × 10⁶ cells/well) were incubated with various concentration of EP (0.1 and 1 ㎎/mL) for 30 min and then stimulated by PMA (50 nM) + A23187 (1 ㎎/mL) for 2 h. Nuclear extracts were isolated using nuclear extraction reagent kit and evaluated for NF-κB (RelA/p65) by Western blot analysis. (B) The relative levels of NF-κB were represented. (C) The caspase-1 activity was measured using a colorimetric assay kit. Results are shown the mean ± SD of experiments. ^#P < 0.5; significantly different from control, ^*P< 0.5; significantly different from PMACI alone.

Caspase-1활성증가는 염증성 사이토카인 발현 증가 및 염증세포 유입을 유도하여 알레르기 염증반응을 악화시킨다. 한련초 추출물의 항염증 기전을 규명하기 위하여 caspase-1활성에 대한 영향을 측정하였다. 실험결과, PMACI로 인한 caspase-1 활성이 증가하였고, 다양한 농도(0.01 0.1, 1 ㎎/mL)의 한련초 추출물에 의하여 caspase-1활성이 유의성 있게 억제됨을 확인하였다. 특히 고농도 (1 ㎎/ml)의 한련초 추출물군에서 caspase-1 활성을 약 33.6% 억제하였다(Fig. 4C).

고 찰

최근 천연물 유래 기능성 소재 개발을 위한 과학적 기반의 다양한 효능 및 기전 규명 연구가 활발히 진행되고 있다. 한련초는 소염 작용, 항균작용, 수렴작용을 하며 항염증, 항응고, 항암 등의 다양한 약리작용이 보고되어 있다. 본 연구에서는 비만세포 매개의 알레르기 염증 개선에 한련초의 효능 및 기전을 입증하여 기능성 소재로서 활용 가능성을 제시하였다.

알레르기성 염증질환은 최근 미세먼지, 대기오염 뿐만 아니라 스트레스, 식생활 서구화, 면역체계 불균형 등 다양한 원인으로 전 세계적으로 발병률이 증가하고 있다. 일반적으로, 알레르기성 염증질환은 치료제는 증상에 따라 스테로이드제, 항히스타민제, 및 항생제등이 사용되고 있다. 하지만 이런 약들의 장기간 복용 시 다양한 부작용을 초래하는 것으로 알려져 있다(Hengge et al., 2006). 따라서 장기간 복용 가능한 천연물 유래 대체치료제 개발이 필요한 실정이다.

산화 스트레스(oxidative stress)와 염증은 밀접한 연관성이 있으며, 항산화 또는 항염 작용을 갖는 물질은 다양한 알레르기 염증 질환의 예방에 중요한 역할을 한다(Blume-Peytavi et al., 2016). 산화 스트레스는 세포 손상을 일으켜 염증을 유발할 수 있으며(Aroun et al., 2012), 항산화제는 인체 내에서 유해 라디칼을 제거함으로써 산화성 손상을 줄이는 데 중요한 역할을 한다. 따라서 천연 항산화제는 다양한 질병에 대한 치료제로 활용될 수 있다. 본 연구에서 한련초 추출물의 DPPH 및 ABTS⁺ 라디칼에 대한 강한 소거능 효과를 확인하였다. 1 ㎎/mL한련초 추출물에서 DPPH 라디칼 소거능은 77.2%, ABTS⁺ 라디칼은 76.2%로 확인하였다. 다른 많은 연구에서 한련초의 폴리페놀 함량을 측정한 결과가 보고되어 있다(Rani et al., 2020). 특히 한련초 물 추출물 (5 ㎎/mL)의 경우 총 폴리페놀 함량은 176.45 ㎎ GAE/g으로 보고되었다(Chan et al., 2014). 본 연구에서는 1 ㎎/mL 한련초 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량은 71.2 ㎎ GAE/g으로 확인하였다. 한련초 추출물이 강력한 천연 항산화제로 활성을 입증하였고 이러한 결과 이 기능성 소재로서의 활용 가능성을 제시하였다.

비만세포는 IgE매개의 즉시형 과민반응에 대표적인 효과기 세포로 두드러기, 알레르기성 비염, 천식 등 즉시형 면역반응은 비만세포가 분비하는 여러 화학적 mediator들에 의해 발생한다(Caughey, 2016). 특정 항원에 대해 특이적인 IgE 항체가 비만세포 FcεRI 수용체와 교차결합되어 비만세포의 탈과립이 일어나고 많은 매개물질을 방출하여 알레르기성 염증을 악화시킨다. 즉시형 면역반응 과정 중에서 비만세포에서 유래된 히스타민은 혈관을 확장시키고 투과성을 증가시켜 알레르기 염증반응을 유도하는 것으로 알려져 있다(Jemima et al., 2014). 본 연구에서 활성화된 비만세포에서 한련초 추출물의 히스타민 생성 조절 효능을 측정하였다. 실험결과, 무처리군에 비해 PMACI처리군에서는 히스타민 생성량이 유의적으로 증가하였고, 반면 한련초 추출물군에서는 농도 의존적으로 히스타민 분비를 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 2B). 특히, 1 ㎎/mL 농도의 한련초 추출물에서 히스타민 억제율은 약 38.8%의 억제 효과(P < 0.5)를 확인하였다. 비만세포 활성화로 염증성 사이토카인 생성이 증가되어 알레르기 염증이 악화된다(Yao et al., 2019). TNF-α는 혈관내피세포 유착 인자의 발현을 유도하여 백혈구 축적을 증가시켜 염증을 악화시킨다(Fedenko et al., 2011). IL-8은 화학주성 인자로 호산구, 호중구, T 림파구의 탐식작용 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있다(Olivera et al., 2018). 알레르기 염증환자의 경우, 염증성 사이토카인의 발현이 증가하는 것이 보고되었고, 이런 현상은 염증 병변에 대한 면역세포의 침투 및 조직손상을 유도한다. 따라서 염증성 사이토카인 조절은 알레르기 염증의 치료제 개발에 중요한 전략이 될 수 있다. 본 연구에서는 활성화된 비만세포에서 한련초 추출물의 다양한 염증성 사이토카인 생성에 대한 조절 효과를 측정하였다. 실험 결과, 대조군에 비하여 PMACI군에서는 IL-6 IL-8 및 TNF-α의 생성량이 현저히 증가하였으나 다양한 농도의 한련초 추출물에서 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 생성량이 농도 의존적으로 감소하였다. 특히 고농도(1 ㎎/mL)의 한련초 추출물군에서 IL-6의 경우 약 35.1%, IL-8의 경우 약 32.8%, TNF-α의 경우 37.5% 억제효과를 확인하였다. 이런 결과로부터 한련초 추출물은 염증성 사이토카인 생성 억제를 통하여 항염증 효능이 있는 것으로 확인되었다.

NF-κB는 다양한 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자로 염증반응, 세포 증식, 발암, 상피세포의 분화 등 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2020; Sakamoto et al., 2018). NF-κB는 억제성 소단위인 IκB와 복합체를 형성하여 불활성 상태로 세포질에 존재한다. 세균성 독소, 염증, 산화성 스트레스 등의 다양한 요인에 의하여 IκB의 인산화 및 분해 되면 NF-κB는 유리되어 핵 내로 이동하여 염증매개 인자의 합성을 증가시킨다(Lappas et al., 2002). 최근 연구결과, caspase-1 활성은 알레르기 염증과 연관성이 있는 것으로 보고되고 있다. 활성화된 caspase-1 은 염증성 사이토카인 생성 및 염증 세포 유입을 증가시켜 염증 반응을 악화시킨다(Moon et al., 2019). Ovalbumin로 유도된 알레르기 동물모델에서 오미자 추출물의 caspase-1 활성 억제를 통한 알레르기 염증 억제 기전이 규명되었다(Han et al., 2017). Caspase-1 결핍모델에서 알레르기 반응 악화 시 Th2 사이토카인 발현이 감소됨을 확인하였다(Menzel et al., 2017). 또한 caspase-1는 NF-κB의 상위조절자로 NF-κB 활성 매개 염증반응을 조절하는 것으로 보고되었다(Lamkanfi et al., 2004). 따라서 caspase-1 활성과 NF-κB 신호 전달 억제는 알레르기 염증 치료를 위한 중요한 전략이 될 수 있다. 본 연구에서는 한련초 추출물의 알레르기 염증 조절 기전규명을 위하여 NF-κB 및 caspase-1 활성에 대한 한련초 추출물의 효과를 측정하였다. 실험결과, PMACI 처리군에서는 핵내의 NF-κB 활성이 증가되었으나 한련초 추출물 처리군에서는 PMACI로 인한 NF-κB의 핵내로 이동 현상이 감소되었다. 또한 caspase-1 활성조절에 대한 한련초 추출물의 효과는 PMACI로 증가된 caspase-1활성이 다양한 농도(0.01 0.1, 1 ㎎/mL)의 한련초 추출물에 의하여 농도 의존적으로 감소되었다. 이를 토대로 한련초 추출물은 활성화된 비만세포에서 NF-κB 및 caspase-1 활성억제를 통하여 알레르기 염증반응을 억제 하는 것으로 확인하였다. 이를 토대로 한련초 추출물은 알레르기 염증질환 치료에 활용가능성이 있는 소재로 사료된다.

결론으로, 본 연구에서는 활성산소 소거능과 총폴리페놀 함량 측정으로 한련초 추출물의 항산화 효능 입증하였다. 또한 활성화된 비만세포에서 염증성 매개인자의 생성 억제와 NF-κB/caspase-1의 활성 조절 통한 알레르기 염증 억제 기전을 규명하였다. 이를 토대로 한련초 추출물은 알레르기 염증 개선 기능성 소재로 활용 가능성을 제시하였다.

적 요

한약재는 다양한 생물학적 특성으로 인해 신약 개발의 중요한 자원이다. 본 연구는 전통적으로 질병 치료에 사용되어 온 다년생 초본인 한련초(Eclipta prostrata, EP)를 대상으로 하였다. 본 연구에서는 비만세포 매개 알레르기 염증 반응에 대한 한련초의 항염증 작용 기전을 규명하였다. 우선, 한련초 추출물의 항산화 활성을 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)과 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)+ 라디칼 소거능으로 평가하였다. 알레르기 염증에 대한 한련초의 약리학적 기전을 밝히기 위해, 활성화된 인간 비만세포주 HMC-1에서 히스타민 및 염증성 사이토카인(IL-6, IL-8, TNF-α) 분비에 미치는 영향을 분석하였다. 또한, 염증 신호 전달 물질인 핵 인자 카파 B(NF-κB)와 caspase-1의 활성화에 대한 억제 효과도 측정하였다. 실험 결과, 한련초 추출물은 강력한 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거 활성을 나타냈다. 활성화된 HMC-1 세포에서 히스타민, IL-6, IL-8, TNF-α의 분비를 유의하게 감소시켰으며, NF-κB와 caspase-1의 활성화도 효과적으로 억제하였다. 결론적으로, 이러한 결과는 한련초가 알레르기성 염증 질환의 새로운 치료제로 개발될 잠재력을 가짐을 시사한다.