서 언
재료 및 방법
식물 재료 및 유식물체 배양 조건
캘러스(callus) 및 신초(shoot) 생성 유도
줄기 신장 (재분화 효율 측정 포함) 및 뿌리 생성 유도
재분화 식물체 순화
통계 분석
결 과
배지 조건에 따른 캘러스 및 부정아 유도 비교
재분화 유도 양상 및 효율 비교
고추 재분화 식물체 확보
고 찰
적 요
서 언
고추(Capsicum annuum L.)는 한국의 음식문화를 대표하는 김치와 고추장 등의 주원료로 이용되는 채소이자 전세계적으로 재배되는 가지과(Solanaceae)에 속하는 향신료 작물이다. 고추는 독특한 맛과 향을 가지고 있으며, 열매 내에 안토시아닌, 아스코르브산, 페놀 화합물, 미네랄, 플라보노이드, 카로티노이드, 캡사이신 및 많은 비타민이 풍부하게 들어 있어, 인간의 건강에 중요한 다양한 항산화제와 화합물을 제공한다(Hernandez-Perez et al., 2020; Suica-Bunghez and Ion, 2020). 그에 따라 고추의 다양한 유전자형에 따른 영양 및 특성 분석과 더불어 수세기 동안 소비형태와 기호성에 따라 우수한 색상과 다양한 기능성을 가진 품종 개량 연구가 지속적으로 진행되어 왔다(Jung et al., 2011b; Luitel et al., 2018; Ro et al., 2021). 그동안 작물 개량 및 품종 개발을 위해 전통적인 선발육종, 교배육종, 돌연변이육종 등의 방법이 사용되어 왔으며, 최근에는 유전자재조합 및 유전자가위(CRISPR) 기술을 이용하여 품종 개량에 들어가는 시간과 비용을 줄이고 원하는 형질만 정확하게 변경할 수 있는 정밀육종이 활발히 연구되고 있다(Park et al., 2019; Wang and Doudna, 2023).
이러한 정밀육종을 작물에 적용하기 위해서는 우선적으로 유전자 조작을 위한 형질전환 방법이 확립되어야 하지만 고추는 형질전환이 매우 어려운 작물로 알려져 있다(Gammoudi et al., 2018; Kothari et al., 2010). 그동안 고추의 중요성으로 인해 형질전환 시스템 확립을 위한 많은 연구가 진행되어 고추 조직배양 및 재분화와 함께 형질전환 조건에 대한 보고가 있었다(Ko et al., 2007; Lee et al., 2004; Li et al., 2003). 하지만 이들 형질전환 방법에 의한 추가 고추 형질전환체가 보고되지 않았기에 재현성이 높거나 안정적인 방법은 아닌 것으로 추정된다. 이후 국내 연구진이 J1-1이라는 defensin 유전자와 항균활성을 갖는 PepEST 효소를 도입시킨 고추 형질전환체를 보고하기도 하였으나(Ko et al., 2016; Seo et al., 2014), 이때 사용된 ‘녹광’ 품종은 오래전에 이용된 것으로 더 이상 구매할 수 없어 이용하기 힘든 상황이다. 따라서 학문적 파급효과가 기대되는 고추 유전자 기능 규명 연구나 유전자교정기술을 이용한 고추 품종 개량을 위해 안정적이고 재현성이 높은 고추 형질전환 시스템 확립이 필요하다.
이러한 상황에 발맞추어 최근 고추 형질전환 시스템 구축을 위한 선행 연구로 다양한 고추 품종을 이용한 재분화 조건 확립 연구가 활발히 진행되고 있다(İzgü et al., 2020; Martínez-Lopez et al., 2021; Shu et al., 2022; Won et al., 2021). 이들 연구에서는 여러 종류의 고추 품종 또는 라인들을 이용한 재분화 조건이 조사되었고, 이를 통해 형질전환 가능한 고추 품종을 확보하고자 하였다. 한 예로, 국내 연구진은 유전자교정기술 적용을 위해 'Dempsey' 품종을 이용한 재분화 방법을 확립하여 보고하였다(Won et al., 2021). 특히, 고추를 포함한 많은 식물의 경우 품종에 따라 재분화에 필요한 생장조절 호르몬 종류 및 농도가 달라져 형질전환이 어려운 이유가 되고 있다.
통상 식물 형질전환 연구를 위해서는 재분화 조건 확립이 선행되어야 한다는 점, 특히 고추는 재분화가 쉽지 않아 정밀육종 방법 적용이 어렵다는 점, 그리고 유전체/유전자 교정이 보편화된 현시점에서 작물의 형질 개량을 위해서는 신뢰할 수 있는 재분화 기술이 중요하다는 점 등을 고려하여 본 연구에서는 서울대학교에서 분양 받은 고추 Core collection 7계통을 대상으로 재분화 조건을 조사하였다. 여기에는 하배축(hypocotyl), 자엽(cotyledon), 잎자루(petiole) 등 세 가지 조직 절편체를 사용하여 5종류의 서로 다른 배지에서의 재분화 조건을 조사함으로써 고추의 효과적인 재분화 조건을 구축하고, 향후 형질전환에 이용할 수 있는 재분화 우수 계통을 확보하고자 하였다. 따라서 본 연구는 고추 형질전환에 사용 가능한 품종을 제공하고, 궁극적으로는 유전자교정기술을 적용하여 형질 개량된 고추 품종을 개발하는데 기여할 수 있을 것으로 여겨진다.
재료 및 방법
식물 재료 및 유식물체 배양 조건
서울대학교 Core collection에서 분양받은 7 계통의 고추 종자를 실험에 사용하였다(Fig. 1, Table 1). 종자의 표면을 70% 에탄올(5분) 및 2% 락스(5분)를 이용하여 소독한 이후, 멸균된 3차 증류수를 이용하여 3회 이상 세척하였다. 이후, 발아 배지(1/2 Murashige and Skoog salts with vitamins (MS), 0.5% Sucrose, 0.5 g/L MES, 0.6% phytoagar, pH 5.8)가 포함된 마젠타박스(72 × 72 × 100 ㎜)에 파종한 후, 25℃, 암조건에서 유근이 나올 때까지 대략 1주 정도 배양하였다. 그리고 고추 식물체를 25℃, 장일 조건(16 h light/8 h dark)의 배양실에서 자엽이 완전히 펼쳐질 때까지 약 1~2주간 추가 배양하였다.
Fig. 1.
Pepper varieties obtained from the Core-collection of Seoul National University. Pictures of fruits harboring seeds are shown as follows: CMV980 (a, IT 229107), Takanotsume (b, IT 238119), Jeju jaerae (c, IT 225358), Yuwolcho (d, IT 240051), Thai hot (e, IT 221677) Yangpyeong jaerae (f, IT 32439), and Chili Bangi (g, IT 240012). IT numbers represent the national registration numbers that are granted by the National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration.
Table 1.
Pepper varieties used for this study
| Namez | IT numbery | Fruit type | Unripe fruit color | Ripe fruit color | Origin |
| CMV980 | IT 229107 | Short | Ivory | Red | Hungary |
| Takanotsume | IT 238119 | Long | Green | Red | South Korea |
| Jeju jaerae | IT 225358 | Long | Dark green | Red | South Korea |
| Yuwolcho | IT 246553 | Long | Green | Red | South Korea |
| Thai hot | IT 221677 | Long | Light green | Red | Thailand |
| Yangpyeong jaerae | IT 32439 | Short | Light green | Red | South Korea |
| Chili Bangi | IT 240012 | Short & Big | Green | Red | Malaysia |
캘러스(callus) 및 신초(shoot) 생성 유도
캘러스 유도를 위해서 배양한 유식물체의 하배축(H), 자엽(C), 잎자루(P)를 surgical blade (Feather; HFE-SB10)를 이용하여 0.5 ㎝ 정도 길이의 절편으로 만들어 사용하였다. 실험은 각 배치(batch)당 60개의 유묘(seedling)를 사용하였고, 유묘에서 하배축은 2-4개, 자엽은 4개, 잎자루(자엽에서 분리한 것만 사용)는 2개 절편을 만들었으며, 각 실험은 3 배치씩 진행하였다. 따라서 각 배치별 고추 하배축 절편은 120~240개, 자엽 절편은 240개, 잎자루 절편은 120개를 사용하여 데이터를 수집하였다. 그리고 trans-zeatin (MBcell, MB-Z5137), zeatin riboside (MBcell, MB-Z5911), BAP (6-Benzylaminopurine; Duchefa biochemie, B0904), IAA (Indole-3-acetic acid; Duchefa biochemie, I0901), GA3 (Gibberellin A3; Duchefa biochemie, G0907), AgNO3 (Sigma-Aldrich, 204390) 등을 포함한 조성이 각기 다른 5가지의 배지(Shoot induction medium, SIM)를 만들어 사용하였다(Table 2). 통상 식물의 캘러스 유도는 사이토키닌 및 옥신 농도비에 의해 조절되는 것으로 알려졌기에 사이토키닌 2종류(zeatin 및 BAP)와 서로 다른 옥신 농도를 조합한 5가지 조건을 실험에 이용하였다(Table 2; Z1, Z2, B1, B2, B3). 참고로 고추는 다른 식물에 비해 옥신 호르몬 농도가 높다고 알려져(Kumar et al., 2012), 0~0.2 ㎎/L 수준의 농도를 사용하였다. 또한 사이토키닌 중에 zeatin 호르몬이 고추 재분화에 유리하다는 결과에 기초하여(Hegde et al., 2017), trans-zeatin 및 zeatin riboside 등 2종을 사용하였다. 재분화 유도 배지가 포함된 페트리디쉬(직경: 9 ㎝, 높이: 1.5 ㎝) plate 당 20~25개의 절편체를 치상하여, 25℃ 장일조건에서 배양하였다. 치상한 절편체는 약 3주 후에 신선한 배지로 계대배양 하면서 캘러스 및 부정아 유도율을 측정하였다. 이때 자른 양쪽 부위 중 한쪽에서만 캘러스가 유도된 경우(One end)와 양쪽 부위에서 모두 캘러스가 유도된 경우(Both ends)을 구분하여 유도율을 계상하였다(캘러스 유도율(%) = 캘러스 유도 절편체 수/전체 절편체 수×100). 또한 캘러스에서 녹색의 부정아가 형성된 비율도 측정하여 비교하였다(부정아 유도율 (%) = 유도된 부정아 수/유도된 캘러스 수×100).
Table 2.
Media composition used for this study
| Components | Shoot induction medium (SIM)y |
Shoot elongation medium (SEM) |
Rooting medium (RM) | ||||
| Z1 | Z2 | B1 | B2 | B3 | |||
| MSz (g/L) | 4.4 | 4.4 | 4.4 | 4.4 | 4.4 | 4.4 | 2.2 |
| Sucrose (g/L) | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 5 |
| MESz (g/L) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| Phytoagar (g/L) | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
| trans-Zeatin (mg/L) | 2 | -x | - | - | - | - | - |
| Zeatin Riboside (mg/L) | - | 2 | - | - | - | 2 | - |
| BAP (mg/L) | - | - | 3 | 3 | 3 | - | - |
| IAA (mg/L) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | - | 0.2 | 0.05 | 0.1 |
| GA3 (mg/L) | - | - | - | 1 | 1 | 1 | - |
| AgNO3 (mg/L) | - | - | 2 | - | 5 | 5 | - |
줄기 신장 (재분화 효율 측정 포함) 및 뿌리 생성 유도
2~3주 간격의 SIM plate에서의 계대배양 이후(절편체 치상 이후 약 6주 소요), 절편체에서 생성된 신초 부분을 잘라낸 후, 줄기 신장 배지(Shoot elongation medium, SEM; 4.4 g/L MS, 3% Sucrose, 0.5 g/L MES, 2 ㎎/L Zeatin Riboside, 0.05 ㎎/L IAA, 1 ㎎/L GA3, 5 ㎎/L AgNO3, 6 g/L Phytoagar, pH 5.8)가 포함된 페트리디쉬(직경: 10 ㎝, 높이: 6 ㎝)에 치상하여 25℃ 장일 조건에서 배양하였다. 그리고 1.5~2주 간격의 계대배양을 거쳐 약 3~4주 후에 신초 형성을 조사하였다. 이때 사용된 절편체 수에서 신초가 나온 절편체 수를 이용하여 재분화 효율(%)를 측정하였다. 이후 rosette 형태의 신초는 제거하고, 완전한 잎의 형태를 띄는 약 1.5 ㎝ 길이로 신장된 신초를 뿌리 유도 배지(Rooting medium, RM; 2.2 g/L MS, 0.5% Sucrose, 0.5 g/L MES, 0.1 ㎎/L IAA, 6 g/L Phytoagar, pH 5.8)를 포함하는 마젠타박스(직경: 7 ㎝, 높이: 9.5 ㎝)로 옮긴 후 25℃ 장일 조건 배양실에서 뿌리 생성을 유도하였다. 보통 뿌리가 생성되기까지 약 3주의 기간이 소요되었다.
재분화 식물체 순화
2 ㎝ 이상의 뿌리가 생성된 재분화 식물체는 상토:질석:펄라이트(2:3:0.5 비율)로 만들어진 토양 화분(직경: 11.5 ㎝, 높이: 11 ㎝)으로 이식된 이후, 25℃ 장일 조건에서 배양하였다. 이때 화분에 반투명 비닐봉지를 씌워 약 5일 동안 습도가 유지되도록 만들었다. 이렇게 순화과정을 거친 재분화 식물체가 15 ㎝ 이 상이 되면 더 큰 화분(직경: 25 ㎝, 높이: 30 ㎝)으로 옮겨 배양하였다.
통계 분석
대조구와의 유의성을 검정하기 위해 IBM SPSS Statistics 20 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 모든 데이터는 세 번의 독립적인 실험을 수행한 평균과 표준편차(SD)를 얻었으며, 분산분석 이후 5% 유의수준에서 던컨의 다중검정(Duncan’s multiple range test)을 통하여 비교하였다.
결 과
배지 조건에 따른 캘러스 및 부정아 유도 비교
본 연구에 사용된 고추 계통은 모두 서울대학교 Core collection에서 분양 받았다(Fig. 1). 최초 10 계통의 종자를 분양 받아 실험을 진행하였으나 3 계통의 종자 발아율이 낮아 최종적으로 7계통을 사용하였다(Table 1). 이들의 고추 열매 형태를 요약하면 단과형 2종(CMV980 및 Yangpyeong jaerae), 대형 단과형 1종(Chili Bangi), 장과형 4종(Takanotsume, Jeju jaerae, Yuwolcho, Thai hot) 등이었다. 이들의 완숙과색은 모두 빨간색이었지만 미숙과색은 아이보리색 1종(CMV980), 녹색 3종(Takanotsume, Yuwolcho, Chili Bangi), 연녹색 2종(Thai hot 및 Yangpyeong jaerae), 진녹색 1종(Jeju jaerae) 등이었다. 따라서 본 연구에서는 다양한 형태와 색을 지닌 열매를 맺는 고추 품종을 대상으로 조직배양 및 재분화 실험을 수행할 수 있었다.
먼저 서로 다른 식물 호르몬 포함 배지(SIM)에서의 캘러스 및 부정아 유도 효율을 조사하였다. 참고로 부정아는 발달되지 않은 신초로 완전한 기관의 형태를 갖지 않은 것을 의미하며, 본 연구에서는 캘러스 유도 이후 green spot이 만들어지는 것으로 조사하였다(Fig. 2, Fig. 3; 빨간 화살표). 그리고 고추 유식물의 세 가지 조직을 이용하였는데, 이는 통상 사용하는 하배축과 자엽 조직에 더해 자엽 끝에 있는 잎자루 조직이 조직 배양 및 형질전환에 유리하다는 결과를 참조하였다(Bagga et al., 2019; Koh, 2022). 또한 조직 절편체는 양쪽 끝을 지니는데, 양쪽 중에서 한쪽에서만 캘러스가 유도되는 경우(One end)와 양쪽 모두에서 유도되는 경우(Both ends)로 나누어 각각의 결과를 도출하였다. 또한 캘러스 및 부정아 유도 배지 조건은 본 연구진이 오래전 ‘녹광’ 품종을 이용하여 구축한 조건에 기초하여 진행하였다(Ko et al., 2016; Seo et al., 2014). 당시 다양한 조건에서의 고추 재분화를 조사하였고, 결론적으로 사이토키닌 및 옥신 농도비가 중요함을 확인한 바 있었다.
Fig. 2.
Callus and bud induction from explants on Z1 and Z2 shoot induction media (SIM). Three types of explants (H/hypocotyl, C/cotyledon, P/petiole) were incubated on SIM plates with trans-Zeatin (Z1) and Zeatin Riboside (Z2) for proximately 3 weeks to investigate the callus and bud induction. Buds developed from the cutting edges of explants are shown with red arrows. Scale bars = 1.0 ㎜.
Fig. 3.
Callus and bud induction from explants in B1, B2, and B3 shoot induction media (SIM). Three types of explants (H, C, P) were incubated on SIM plates with BAP and different concentrations of IAA (B1, B2, and B3) for 3 weeks to investigate the callus and bud induction. Buds developed from the cutting edges of explants are shown with red arrows. Scale bars = 1.0 ㎜.
이에 본 연구에서는 먼저 사이토키닌 호르몬인 trans-zeatin (Z1) 및 zeatin riboside(Z2)를 포함하는 배지(0.1 ㎎/mL IAA 포함)에서 캘러스 및 부정아 유도율을 조사하였다(Fig. 2, Table 3). 그 결과, 7 계통의 고추 모두 90% 이상의 캘러스가 유도되는 조건이 있음을 확인하였다. 특히, 잎자루 조직을 사용하는 경우에 모든 계통에서 높은 캘러스 유도율을 확인할 수 있었으며, 자엽과 하배축 조직에서는 사용된 고추 품종에 따라 차이를 보여주었다(Table 3). 대부분의 계통이 Z1 및 Z2 배지 조건에서 유사한 캘러스 유도율을 보여주었으나 Both ends 기준으로 CMV980은 Z1 배지에서, Jeju jaerae 및 Yangpyeong jaerae는 Z2 배지에서 캘러스가 더 잘 유도되었다. 통상 부정아 형성이 잘 되어야 재분화 효율이 높아지기에, 다음으로 부정아 유도율을 비교분석 하였다. 먼저 절편체 양쪽 중 하나에서만 캘러스가 유도된 경우(One end)보다 양쪽에서는 유도된 경우(Both ends)에 부정아 형성율이 높은 것을 관찰하였다. 부정아 유도 결과를 요약해 보면, Jeju jaerae, Thai hot, Chili Bangi 등 3계통에서는 부정아가 유도되지 않거나 매우 낮은 유도율을 보여주었다(Table 3). 가장 높은 부정아 유도율은 CMV980 계통에서 관찰되었으며(잎자루 조직 사용 시, Z1 조건에서 약 90%, Z2 조건에서 약 96%), 다음으로 Yuwolcho 계통의 부정아 유도율이 높게 관찰되었다(잎자루 조직 및 Z2 조건, 약 58%). 전반적으로 잎자루 조직이 다른 조직보다 높은 부정아 유도율을 보여주었으며, 하배축 조직을 이용하는 경우 Takanotsume(약 38%), Yuwolcho (약 33%), CMV980(약 21%) 순으로 높았으며, 다른 계통은 10% 이하로 관찰되었다. 자엽 조직을 이용하는 경우, 4 계통에서는 부정아 유도가 전혀 이루어지지 않았으며, CMV980(약 43%), Yuwolcho(약 13%), Yangpyeong jaerae(약 6%) 순으로 관찰되었다.
Table 3.
Callus and bud induction percentages in two types of Zeatin-containing SIM
| Accession name | Explant type | Callus induction (%) | Bud induction (%)z | ||||
| Z1 | Z2 | Z1 | Z2 | ||||
| One end | Both ends | One end | Both ends | ||||
| CMV980 | Hypocotyl | 42.7±9.6 | 53.5±12.7 | 85.8±10.0 | 14.2±10.0 | 22.7±3.3d | 21.2±4.0e |
| Cotyledon | 8.3±11.8 | 91.7±11.8 | 75.1±2.2 | 18.8±11.2 | 20.1±3.1de | 43.4±16.2cd | |
| Petiole | -y | 100 | - | 100 | 89.5±8.3a | 96.4±3.6a | |
| Takanotsume | Hypocotyl | 67.5±10.9 | 25.4±5.6 | 70.3±10.5 | 21.5±10.7 | 15.2±6.9ef | 37.7±9.0d |
| Cotyledon | - | 100 | - | 100 | - | - | |
| Petiole | 4.2±7.2 | 95.8±7.2 | - | 100 | 30.6±1.1c | 51.1±1.9bc | |
| Jeju jaerae | Hypocotyl | 80.6±10.9 | 10.0±10.0 | 50±0.0 | 46.7±5.8 | - | - |
| Cotyledon | 20.0 ±10.0 | 80.0±10.0 | 16.7±5.8 | 80 | - | - | |
| Petiole | - | 100 | - | 100 | - | 1.11±1.9h | |
| Yuwolcho | Hypocotyl | - | 100 | - | 100 | 35.2±10.1c | 33.3±8.6d |
| Cotyledon | 5.0±5.0 | 95.0±5.0 | 1.7±2.9 | 96.7±2.9 | 12.0±1.7f | 13.7±4.3ef | |
| Petiole | 1.7±2.9 | 98.3±2.9 | - | 100 | 41.7±2.9b | 58.3±15.3b | |
| Thai hot | Hypocotyl | 37.7±21.9 | 62.3±21.9 | 33.5±10.1 | 64.4±10.1 | - | 7.3±6.8fgh |
| Cotyledon | - | 100 | - | 100 | - | - | |
| Petiole | - | 100 | - | 100 | - | 10.6±1.6efgh | |
|
Yangpyeong jaerae | Hypocotyl | 54.6±5.5 | 45.4±5.5 | 20.2±4.1 | 79.8±4.1 | 1.9±0.3g | 2.4±0.5gh |
| Cotyledon | 23.5±6.5 | 2.4±4.1 | 33.3±10.9 | 2.4±4.1 | - | 6.1±5.4fgh | |
| Petiole | 92.5±6.9 | 7.5±6.9 | - | 100 | 10.7±2.8f | 13.1±4.5efg | |
| Chili Bangi | Hypocotyl | 19.5 8.9 | 80.5±8.9 | 18.1±1.5 | 81.9±1.5 | - | - |
| Cotyledon | 1.1±1.9 | 98.9±1.9 | - | 100 | - | - | |
| Petiole | - | 100 | - | 100 | - | - | |
다음으로 BAP 사이토키닌과 다양한 농도의 옥신으로 구성된 조건에서의 캘러스 및 부정아 유도율을 조사하였다(Fig. 3, Table 4). 이때는 절편체 양쪽에서 캘러스가 유도된 경우(Both ends)만 사용하였으며, 결과적으로 BAP 사이토키닌이 포함된 조건에서도 zeatin 포함 조건과 유사하게 전반적으로 잎자루 조직에서의 캘러스 유도율이 높게 나왔고, 다음으로 자엽, 하배축 순으로 관찰되었다(Table 4). 그리고 부정아 유도율을 비교한 결과, B1 조건보다는 B2 (IAA 없이 GA3 포함) 및 B3 (IAA, GA3, AgNO3 포함) 조건에서 높게 관찰되었으며, 가장 높은 부정아 유도율은 zeatin 조건에서의 결과와 유사하게 CMV980 계통에서 관찰되었다(잎자루; B2 조건 약 88%, B3 조건 약 93%). 다음으로 Takanotsume(자엽; B2 조건 약 69%), Yangpyeong jaerae(잎자루; B1 조건 약 41%), Jeju jaerae/Yuwolcho(잎자루; B2 조건 30%대), Thai hot(잎자루 및 하배축; B3 조건 30%대), 그리고 Chili Bangi(잎자루; B3 조건 10%대)로 나타났다.
이상의 결과를 종합해 보면, 계통에 따라 zeatin 또는 BAP 사이토키닌 포함 조건에서의 캘러스 및 부정아 유도율에서 차이가 나는 것을 관찰할 수 있었다. 최대 부정아 유도율을 기준으로 살펴보면, CMV980(잎자루, 96.4%) 및 Yuwolcho(잎자루, 58.3%) 계통은 Z2 배지, Takanotsume(자엽, 68.9%) 및 Jeju jaerae(잎자루, 38.3%) 계통은 B2 배지, Thai hot(하배축, 33.3%) 및 Chili Bangi(잎자루, 13.9%) 계통은 B3 배지, 그리고 Yangpyeong jaerae(잎자루, 40.6%) 계통은 B1 배지에서 가장 높게 나타났다. 특히 Chili Bangi 계통은 zeatin 배지에서는 부정아가 거의 유도되지 않았지만, B3 배지에서는 부정아 유도가 이루어졌다. 전체적으로 CMV980 계통이 zeatin 및 BAP 조건 모두에서 가장 우수한 캘러스 및 부정아 유도율을 보여주었다. 다음으로 Yuwolcho 및 Takanotsume 계통 순으로 유도율이 높게 확인되었다.
Table 4.
Callus and bud induction percentages in three conditions of BAP-containing SIM
| Accession name | Explant type | Callus induction (%) | Bud induction (%)z | ||||
| B1 | B2 | B3 | B1 | B2 | B3 | ||
| CMV980 | Hypocotyl | 49.0±3.1 | 53.5±6.5 | 37.2±8.0 | 1.9±2.1f | 2.3±0.4e | 0.6±1.1h |
| Cotyledon | 74.0±11.6 | 85.5±1.0 | 100 | 15.5±2.7cd | 9.8±4.8de | 21.5±9.2def | |
| Petiole | 100 | 93.3±5.7 | 100 | 77.6±11.7a | 88.3±14.9a | 92.8±8.0a | |
| Takanotsume | Hypocotyl | 42.7±38.6 | 27.4±14.4 | 6.5±6.7 | 9.8±5.0def | 16.3±3.3d | 56.1±14.6b |
| Cotyledon | 100 | 39.2±20.2 | 100 | 5.8±5.9ef | 68.9±16.8b | 24.4±3.8def | |
| Petiole | 92.6±7.7 | 24.2±19.5 | 95.6±7.7 | 36.2±2.6b | 44.5±2.0c | 40.0±3.3c | |
| Jeju jaerae | Hypocotyl | 80.6±20 | 96.7±5.8 | 28.5±14.7 | -y | - | - |
| Cotyledon | 100 | 63.9±16.3 | 56.7±15.3 | - | - | - | |
| Petiole | 96.7±5.8 | 90±17.3 | - | 1.6±2.8f | 38.3±10.4c | 28.33±2.8cde | |
| Yuwolcho | Hypocotyl | 57.1±8.3 | 93.6±5.5 | 84.1±2.7 | 8.9±0.7def | - | - |
| Cotyledon | 86.7±2.9 | 96.7±2.9 | 100 | 8.3±0.3def | - | - | |
| Petiole | 100 | 100 | 100 | 21.7±7.6c | 35.0±8.7c | 16.7±10.7efg | |
| Thai hot | Hypocotyl | 17.1±6.2 | 56.1±5.5 | - | 4.2±3.6f | - | 33.3±5.2cd |
| Cotyledon | 100 | 98.0±3.4 | 66.8±11.5 | - | - | - | |
| Petiole | 100 | 100 | 100 | 15.1±13.1cd | 16.3±1.1d | 32.3±17.2cd | |
|
Yangpyeong jaerae | Hypocotyl | 5.3±4.7 | 64.8±10.6 | 13.4±12.0 | 3.3±1.7f | - | 2.8±1.8h |
| Cotyledon | - | 11.7±10.2 | 23.0±7.9 | 14.0±5.5cde | 8.9±1.0de | 5.5±2.4gh | |
| Petiole | 94.4±10.0 | 84.4±2.9 | 94.6±6.4 | 40.6±4.6b | 18.4±10.1d | 17.8±3.3efg | |
| Chili Bangi | Hypocotyl | 69.5±3.1 | 4.0±4.2 | 79.0±2.7 | - | - | - |
| Cotyledon | 55.2±4.8 | - | 8.4±2.2 | - | - | - | |
| Petiole | 2.3±4.0 | - | - | - | - | 13.9±17.3fgh | |
재분화 유도 양상 및 효율 비교
식물 형질전환 조건 확립을 위해서는 재분화 조건 최적화가 선행되어야 하고, 이때 절편체(explant)에서 유도된 부정아 또는 green spot에서 신초가 형성되어야 형질전환 연구를 효율적으로 추진할 수 있다. 이에 절편체에서 유도된 캘러스와 부정아 유도율 조사를 거쳐 신초 유도를 조사하였다(Table 5). 결과를 살펴보면, 대부분의 계통에서 절편체에서 하나 이하의 신초가 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 Jeju jaerae 및 Chili Bangi 계통에서는 신초 형성이 거의 관찰되지 않았다. 2개 이상의 신초를 형성하는 계통은 CMV980(최대 2.67, Z2 조건), Yuwolcho(최대 2.56, Z1 조건), Takanotsume(최대 2.31, B2 조건) 등이었으며, 이 결과는 부정아 유도가 잘 되었던 조건과 거의 일치하였다. 전반적으로 zeatin riboside 포함 Z2 조건과 BAP 포함 B3 조건에서 신초 유도가 잘 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 특히, CMV980 계통은 zeatin 포함 조건에서 모든 조직에서 신초가 형성되어 재분화율이 가장 높은 것으로 나타났다. 다음으로 Yuwolcho 계통에서 하배축 조직과 zeatin 포함 조건을 사용하는 경우 재분화율이 높게 관찰되었다.
가장 우수한 재분화율을 보여준 CMV980을 기준으로 재분화 효율(사용된 절편체 수 대비 신초 생성한 절편체)을 조사한 결과, Z1 (11.84~36.84%), Z2 (23.26~47.89%), B1 (3.92~28.36%), B2 (2.33~26.03%), B3 (2.78~38.89%) 등으로 관찰되었다. 사용된 조직을 기준으로 재분화 효율을 살펴보면, 하배축 조직을 사용한 경우 Z2 배지 조건에서 가장 높았고(23.26%), 다음으로 Z1 (11.84%), 그리고 BAP 포함 조건에서는 모두 5% 이하로 관찰되었다. 자엽 조직을 사용한 경우도 Z2 배지 조건에서 가장 높았고(35.71%), 다음으로 Z1 (27.78%) 및 B3 (25.76%), 그리고 B1 및 B2 조건에서는 10% 이하로 관찰되었다. 잎자루 조직을 사용한 경우에도 Z2 배지 조건에서 가장 높았고(47.89%), 다음으로 B3 (38.89%), Z1 (36.84%), B1 (28.36%), B2 (26.03%) 순으로 관찰되었다. 결론적으로 CMV980 계통의 재분화는 Z2 배지 조건에서 잎자루 조직을 이용하여 수행하는 경우 약 48%의 높은 효율을 얻을 수 있었다.
Table 5.
Shoot formation from explants
| Accession name | Explant type | No. of shoots per explant | ||||
| Z1 | Z2 | B1 | B2 | B3 | ||
| CMV980 | Hypocotyl | 2.11±0.70 | 2.67±0.70 | 1z | 1 | 1 |
| Cotyledon | 1.33±1.10 | 1.44±0.73 | 1 | 1 | 1 | |
| Petiole | 1.67±1.00 | 2.22±0.83 | 1.77±0.83 | 1 | 1 | |
| Takanotsume | Hypocotyl | 1.25±0.46 | 1.60±0.63 | 1.20±0.44 | 1 | 1.20±0.40 |
| Cotyledon | -y | - | - | - | - | |
| Petiole | 1 | 1.33±0.5 | - | 2.31±1.38 | 1.81±0.86 | |
| Jeju jaerae | Hypocotyl | - | - | 1 | 1 | - |
| Cotyledon | - | - | - | - | - | |
| Petiole | - | 1 | 1 | - | 1 | |
| Yuwolcho | Hypocotyl | 2.56±1.01 | 2.33±1.22 | 1.67±0.87 | - | 2.00±1.00 |
| Cotyledon | - | - | - | - | - | |
| Petiole | 1.22±0.44 | 1.33±0.50 | 1 | 1.75±1.04 | 1.78±0.67 | |
| Thai Hot | Hypocotyl | - | 2.00±0.71 | 1 | - | 1.25±0.46 |
| Cotyledon | - | - | - | - | - | |
| Petiole | - | - | - | - | 1.81±1.04 | |
|
Yangpyeong jaerae | Hypocotyl | 1 | 1.33±0.58 | 1 | - | 1 |
| Cotyledon | - | - | 1.22±0.44 | - | 1.11±0.33 | |
| Petiole | - | - | 1 | - | 1.22±0.44 | |
| Chili Bangi | Hypocotyl | - | 1 | 1 | - | - |
| Cotyledon | - | - | - | - | - | |
| Petiole | - | - | - | - | - | |
고추 재분화 식물체 확보
상기 결과에서 CMV980 계통이 캘러스 및 부정아 유도, 신초 형성, 재분화 효율에서 가장 좋은 결과를 보여주었으므로, CMV980 계통을 이용하여 고추 재분화 식물체 확보를 계속 진행하였다(Fig. 4). 과정을 요약하면, 약 2~3주간 배양한 유식물체를 이용하여 하배축, 자엽, 그리고 잎자루 절편체를 Z2 배지에 배양하였다(Fig. 4A,B). 이후 갈변화된 캘러스 및 조직 절편을 제거하면서 계대배양을 진행하여 신초를 유도하였다(Fig. 4C). 절단면에 형성된 캘러스에서 신초 유도와 줄기를 신장시킨 후(Fig. 4D), 기관 분화가 일어난 개체를 뿌리 유도 배지(RM)에서 배양하여 뿌리 생성을 유도하였다(Fig. 4E). 이후 뿌리가 형성된 재분화 식물체를 흙으로 옮겨 순화 과정을 거쳐 배양하였으며, 성숙 식물체에서 개화와 고추 열매가 맺히는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4F,G). 이상의 과정으로 재분화에 소요되는 시간을 정리하면 절편체 치상부터 신초 유도까지 약 6주, 줄기 신장 약 3~4주, 뿌리 유도 약 3주 등을 거쳐 약 12~13주를 거쳐 재분화 식물체를 얻을 수 있고, 이후 본 연구실의 조건에서는 토양에서 약 3~4개월 후에 열매가 맺히는 것을 확인할 수 있었다.
Fig. 4.
Regeneration of CMV980 variety. (A) Pepper seedings used for regeneration. Seeds were germinated in the dark and incubated for 5 days under long day condition (16 h light/8 h dark photoperiod). (B) Explants placed on a Z2 plate. C, cotyledon; P, petiole; H, hypocotyl. (C) Induced calli and buds after growth of 6 weeks on Z2 plates. Buds and shoots are indicated by blue and red arrows. (D) Elongated shoots from a callus. (E) Rooted platelets. (F) A fully-grown regenerated plant on soil. (G) Immature pepper fruit (in ivory color) in a regenerated plant. Scale bars = 5.0 ㎜.
고 찰
고추는 기내(in vitro) 조건에서 세포, 조직 및 기관 분화, 그리고 식물 재분화가 어려운 식물이기에 형질전환이 어려운 작물로 알려져 있다(Gammoudi et al., 2018; Martínez-Lopez et al., 2021). 이에 고추 유전자 연구는 주로 애기장대와 같은 모델 식물에서 진행되고 있어 고추에서 유전자의 실제 기능 분석에 제약이 있으며, 또한 유전자재조합이나 유전자교정 등 생명공학기술을 이용한 품종 개발도 어려운 실정이다. 고추는 또한 경제성이 높은 작물이기에 소비자의 소비형태와 기호성에 따른 다양한 품종 개발이 요구되고 있다. 이에 안정적이고 재현성이 높은 고추 형질전환 시스템이 필요한데, 우선적으로 고추 재분화 조건 확립이 선행되어야 한다(Shu et al., 2022). 이를 위하여 고추 조직배양에서 주로 사용하는 하배축이나 자엽 대신 뿌리 조직을 사용하거나 형질전환에 주로 사용되는 Agrobacterium tumefaciens 대신 A. rhizogenes 균주를 이용하기도 하고, 형질전환 과정을 GFP (green fluorescent protein)를 이용하여 추적하거나, BABY BOOM 전사인자와 같이 재분화 및 형질전환에 도움되는 유전자를 이용하는 사례들이 보도되었다(Aarrouf et al., 2012; Heidmann et al., 2011; Jung et al., 2011a). 하지만 현재까지도 효율적인 고추 형질전환 시스템이 구축되지 않아, 형질전환 연구에 앞서 고추 재분화 조건 확립 연구가 지속되고 있다(Hegde et al., 2017; İzgü et al., 2020; Kim and Lim, 2019; Martínez-Lopez et al., 2021; Santana-Buzzy et al., 2005; Shu et al., 2022; Won et al., 2021). 본 연구진의 경우, 과거 다양한 잔디 품종의 형질전환 연구를 수행한바 있는데, 재분화 효율이 우수한 잔디 품종이 형질전환 가능함을 경험하였다(Kim et al., 2007). 또한 바이오에너지 작물인 억새(Miscanthus sinensis)의 아그로박테리움 매개 형질전환 방법을 최초로 구축하여 보고한 적이 있는데, 이때에도 서울대학교에서 분양 받은 7종의 억새 germplasm 종자를 이용하여 재분화율이 높은 2종의 형질전환 시스템을 구축한바 있었다(Hwang et al., 2014). 따라서 고추 형질전환 시스템 구축을 위해서는 우선적으로 재분화 효율이 우수한 고추 품종을 확보하여야 한다. 이를 위해 본 연구에서는 서울대학교의 고추 Core collection에서 다양한 계통의 종자를 분양 받아 재분화 분석을 진행하였다 (Fig. 1, Table 1).
본 연구에서는 과거 “녹광” 품종을 이용한 재분화 및 형질전환 조건과 고추의 재분화에 낮은 옥신과 zeatin 사이토키닌이 유리하다는 결과를 결부시켜(Bagga et al., 2019; Ko et al., 2016; Kumar et al., 2012; Seo et al., 2014), 낮은 옥신 농도와 zeatin 및 BAP 사이토키닌 조성을 달리한 조건에서 고추의 캘러스 및 부정아 유도 관찰과 재분화율을 조사하였다. 그리고 AgNO3 및 지베렐린 호르몬(GA3)을 캘러스 유도와 줄기 신장 촉진을 위해 첨가하였다(Table 2). 참고로 예전에 사용한 ‘녹광’ 품종의 고추 종자는 더 이상 확보하지 못하기에, 서울대학교 Core collection 계통들을 이용하였다. 결론적으로 zeatin 포함 배지 조건이 캘러스 및 부정아 유도에 유리한 것으로 관찰되었다(Fig. 2vs. Fig. 3). 그리고 캘러스 및 부정아 유도율을 비교한 결과, 각 계통별로 최적 조건에서 차이를 보였다: Z2 배지(CMV980, Yuwolcho), B2 배지(Takanotsume, Jeju jaerae), B3 배지(Thai hot, Chili Bangi), B1 배지(Yangpyeong jaerae)(Table 3,4). 특히, 캘러스 유도율은 대체로 높게 유도되었으나 부정아 생성율에서 계통과 배지 조건에 따라 비교적 큰 차이를 보여주었다. 이는 유도된 캘러스가 모두 좋은 것은 아니고 일부만 신초 분화가 진행되는 캘러스임을 제시하고 있으며, 향후 유도된 캘러스 중에서 기관분화가 가능한 것을 선발하여 사용해야 할 것으로 여겨진다. 또한 본 연구에서는 세 가지 조직을 사용하였는데, 이 중에서 자엽과 연결된 잎자루 조직(Fig. 4B)에서 캘러스 및 부정아 유도율이 높았으며, 다음으로 하배축과 자엽 조직에서는 계통별로 차이를 보였다. 그동안 고추 재분화 실험에는 하배축과 자엽이 주로 이용되었는데, 일부 연구에서 잎자루 조직이 유리하다는 결과를 바탕으로(Bagga et al., 2019), 본 연구에서 사용해 본 결과 잎자루 절편에서 재분화 효율이 높게 나타났는데, 이에 대한 이유는 추가 연구를 통해 규명되어야 할 것으로 여겨진다. 결론적으로 사용하는 계통에 따라 사용 조직과 배지 조성을 달리해야 하는 것으로 여겨지는데, 이는 고추의 경우 품종별로 조직배양 양상이나 재분화가 다르게 나타난다는 보고와 일치하는 것으로 여겨진다(Kothari et al., 2010).
최종적으로 재분화는 절단면에서 유도된 캘러스에서 신초 형성 유무로 판단하였으며, CMV980, Yuwolcho, Takanotsume 등 3 계통에서 확인되었다(Table 5). 특히, CMV980 조직을 zeatin 포함 배지에 배양하였을 때 재분화 효율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다(약 48%). 본 연구에서는 CMV980 유식물의 절편체 치상부터 재분화 식물체를 토양으로 내보내는 데까지 약 12~13주가 소요되었다(Fig. 4). CMV980 다음으로 재분화 효율이 높은 것은 Takanotsume 및 Yuwolcho 계통이 있었는데, 신초 형성을 기준으로 판단했을 때 Yuwolcho 계통이 더 나은 것으로 여겨진다. 참고로 CMV980 및 Yuwolcho, 두 품종 모두 BAP를 사용한 배지에서 보다 zeatin 사이토키닌을 사용한 배지에서 재분화 효율이 높았다. 다만, CMV980은 하배축, 자엽, 잎자루 세 조직 모두에서 재분화가 잘 일어나지만 Yuwolcho는 하배축 및 잎자루 조직에서만 재분화가 잘 일어나는 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구를 통해 고추 형질전환 시스템 구축에 활용될 수 있는 품종으로 CMV980 및 Yuwolcho 계통을 제시하고 있다. 또한 본 연구는 고추 유전자 기능 연구나 조직배양을 수행하는 연구자들에게 연구 대상 선택의 폭을 증가시킬 수 있을 것으로 여겨지며, 향후 이들 계통을 이용한 형질전환 시스템이 구축된다면, 최근 활발히 연구되는 유전자교정기술을 이용한 다양한 고추 형질 개량이나 육종소재 개발에 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
적 요
고추(Capsicum annuum L.)는 전 세계적으로 재배되고 있는 채소이자 향신료 작물이다. 고추 열매는 독특한 맛과 향을 지니면서 인체 건강에 중요한 항산화제와 다양한 화합물을 제공하기에 경제적 가치가 높다. 또한 소비자의 기호에 따른 새로운 고추 품종에 대한 수요도 높다. 하지만 고추는 조직 및 기관 분화와 식물 재분화가 어려운 식물이기에 유전자재조합 및 유전자교정과 같은 새로 개발된 기술을 사용하여 요구되는 품종 개발이 어려운 상황이다. 본 연구에서는 서울대학교 Core collection에서 분양 받은 7계통의 고추를 이용하여 조직 배양 및 재분화 조건을 조사하였다. 여기에는 서로 다른 사이토키닌과 옥신 농도로 구성된 여러 가지 배지 조성을 사용하여 캘러스와 부정아 유도, 그리고 신초 형성을 관찰하였다. 그 결과, 호르몬 조성에 따라 캘러스 유도 및 신초 형성에서 품종별 차이가 있는 것으로 확인하였으며, zeatin riboside를 함유한 배지와 유묘의 잎자루 부분을 사용한 경우 재분화율이 가장 높게 나타났다. 특히 사용된 7 계통의 고추 중에서 CMV980 계통이 다른 품종에 비해 월등히 높은 재분화 효율(약 48%)을 나타냈고, Yuwolcho 계통이 그 뒤를 이었다. 따라서 본 연구는 CMV980 및 Yuwolcho 계통을 고추 형질전환에 활용될 수 있는 우수한 품종 후보로 제공하며, 이는 향후 유전자교정기술 등을 이용한 다양한 품종 개발에 기여할 수 있을 것이다.
