Research Article

Korean Journal of Plant Resources. 1 October 2024. 455-460
https://doi.org/10.7732/kjpr.2024.37.5.455

ABSTRACT


MAIN

  • 서 언

  • 재료 및 방법

  •   시료준비

  •   세포배양

  •   세포독성 평가

  •   Extracellular melanin 생성 억제 활성 평가

  •   Intracellular melanin 생성 억제 활성 평가

  •   SDS-PAGE 및 Western blot 분석

  •   Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)

  •   통계분석

  • 결과 및 고찰

  • N. debneyi 지상부의 에탄올 농도별 추출물의 melanin 생성 억제활성

  • N. debneyi 지상부의 50% 에탄올 추출물의 농도별 melanin 생성 억제활성

  • N. debneyi 지상부의 50% 에탄올 추출물의 tyrosinase 발현 억제 활성

  • 적 요

서 언

멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocyte)의 멜라노솜(melanosomes)에서 생성되며 피부, 모발, 눈의 색소에 큰 영향을 미친다고 알려져 있다(Regad, 2013). 또한, 멜라닌은 자외선이나 활성산소로부터 인체를 보호하는 역할도 한다고 알려져 있다(Lee et al., 2005). 멜라닌 생성의 과도한 감소는 멜라닌세포의 비정상적인 발달과 기능 장애와 연관되어 있으며(Otręba et al., 2013; Otręba et al., 2014), 그 결과 햇빛의 유해한 자외선으로부터 피부를 보호하는 능력이 감소하게 된다. 반면, 멜라닌의 과도한 생성 및 축적은 멜라스마(Melasma), 염증 후 과색소침착(Post-inflammatory hyperpigmentation), 태양광선 반점(Solar lentigo), 주근깨(Ephelides), 커피색 반점(café-au-lait macules)과 같은 피부 질환을 유발할 수 있다(Goswami and Sharma, 2020). 또한, 멜라닌의 과잉 생성은 단순히 병리학적 문제뿐만 아니라 미용적인 문제로도 인식되고 있다(Kim et al., 2022). 그리하여, 색소침착을 예방하고 미백효과를 얻으려면 멜라닌 생성과정을 억제하여 멜라닌 생성을 감소시키는 것이 필요하다(Choi et al., 2022; Lee et al., 2022).

Nicotiana debneyi (N. debneyi)는 가지과(Solanaceae)에 속하는 4배체 야생담배로 호수 동부 해안이 원산지로 알려져 있다(Zeng et al., 2021). N. debneyi는 다양한 환경에 적응할 수 있는 강한 생존력을 가지고 있기 때문에 저항성 관련 유전적 특성 연구에 많이 활용되고 있다. Nicotiana 속 식물들은 다양한 약리학적 활성을 가지고 있다고 알려져 있다. 이들 식물에는 solanesol, cembranoids와 같은 화합물이 풍부하여 항염증 활성, 항산화 활성, 항균활성 그리고 신경보호 활성 등을 나타낸다고 보고되고 있다(Zhang et al., 2024). 특히 cembranoids는 암세포의 성장과 전이의 억제를 통해 항암활성도 나타낸다고 보고되 있다(Zhang et al., 2024). Nicotiana 속 식물들은 이러한 다양한 약리학적 활성으로 신경퇴행성 질환, 염증성 질환 및 암 치료를 위한 의약품 개발에 유용할 것으로 인식되고 있다(Zhang et al., 2024). 그러나, Nicotiana 속 식물들의 약리학적 활성연구는 주로 Nicotiana tabacum에 초점되어 있는 실정이다. 그리하여 본 연구에서는 야생 담배의 일종인 Nicotiana debneyi (N. debneyi)의 멜라닌 생성억제활성을 검증하여 미백화장품 원료로의 활용 가능성을 평가하였다.

재료 및 방법

시료준비

Petri-dish (15 ㎜)에 증류수로 적신 6장의 여과지를 놓은 후 N. debneyi의 종자를 치상하고 1주일간 발아시켰다. 1주일 후 상업용 원예용 상토(Baroker, Seoul Bio, Chungbuk, Korea)을 채운 125구 플러그 트레이에 담배 묘를 이식하고 18일 동안 온실 조건에서 재배하였다. 18일 후 20개의 담배 묘를 상업용 원예용 상토가 채워진 개별 플라스틱 화분(직경 12 ㎝)에 정식 후 밀폐형 식물 생산 시스템에서 27일간 재배하였다. 밀폐형 식물 생산 시스템의 조건은 기온 23±2.3℃, 상대습도 40±3%, 이산화탄소 농도 472±0.5 μmol·mol-1, 백색 발광 다이오드(LED) PPFD 140 μmol·m-2·s-1, 광주기는 명기 16시간과 암기 8시간이었다. 재배기간 동안 토마토 배양액(전기전도도 EC 1.2 d·Sm-1. ㏗ 5.8∼6.0)을 2일∼3일에 한 번씩 저면관수으로 공급하였다. 수확 후 기부를 중심으로 지상부와 지하부는 분리되었고 지상부는 60℃ 건조기에서 4일간 건조한 후 분쇄하였다. 분쇄된 N. debneyi 지상부를 20배 볼륨의 30%, 50%, 그리고 70% 에탄올에 침지한 후 20℃에서 150 rpm으로 교반하면서 24시간 동안 추출한 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 N. debneyi 지상부 에탄올 추출물을 얻었다.

세포배양

본 연구에 사용된 B16F10 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. B16F10 세포는 10% Fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin과 100 ㎍/mL streptomycin이 함유된 DMEM/F-12 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 하에서 배양되었다.

세포독성 평가

추출물이 B16F10의 세포생존에 미치는 영향은 MTT assay를 통해 평가하였다. B16F10 세포를 1×104 cells/well씩 96 well-plate에 분주한 후 24시간동안 37℃, 5% CO2 하에서 배양하였다. 24시간 후 추출물을 농도별로 처리하고 37℃, 5% CO2 하에서 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후 각 well에 MTT 용액(1 ㎎/mL)을 50 μL씩 첨가하고 4시간 반응시킨 후, 상등액을 제거하고 DMSO를 100 μL씩 각well에 첨가하여 formazan crystal을 녹인 후 UV/Visible spectrophotometer (Xma-3000PC, Human Corporation Co., Seoul, Korea)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다

Extracellular melanin 생성 억제 활성 평가

B16BL6 세포를 6-well plate에 3×104 cells/mL로 분주하고 24시간이 지난 후 세포가 plate에 완전히 부착된 것을 확인한 다음 추출물을 농도별로 2시간 전처리 하였다. 2시간 후 100 μM의 IBMX를 처리하여 melanin 생성 반응을 촉진시켰다. IBMX 처리 48시간 후 세포 배양액을 UV/Visible spectrophotometer (Xma-3000PC, Human Corporation Co., Seoul, Korea)를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다

Intracellular melanin 생성 억제 활성 평가

B16BL6 세포를 6-well plate에 3×104 cells/mL로 분주하고 24시간이 지난 후 세포가 plate에 완전히 부착된 것을 확인한 다음 추출물을 농도별로 2시간 전처리 하였다. 2시간 후 100 μM의 IBMX를 처리하여 melanin 생성 반응을 촉진시켰다. IBMX 처리 48시간 후 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich Co.)을 함유한 10 mM phosphate buffer (㏗ 6.8)를 100 μL 가하고 5분간 교반한 후 원심분리 하여 cell pellet을 멜라닌 정량에 사용하였다. 분리된 pellet에 1 N NaOH 100 μL와 증류수 200 μL를 가하고 60℃에서 1시간 반응하여 완전히 녹인 후 UV/Visible spectrophotometer (Xma-3000PC, Human Corporation Co., Seoul, Korea)를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

SDS-PAGE 및 Western blot 분석

세포로부터 단백질을 추출하기 위해, 처리 후 세포를 4℃에서 유지된 1 × phosphate-buffered saline (PBS)로 2회 세척한 후, protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich Co.)과 phosphatase inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich Co.)이 포함된 radioimmunoprecipitation buffer (Boston Bio Products, Ashland, MA, USA)를 4℃에서 30분간 처리하여 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 Bicinchoninic acid protein assay (Pierce Biotechnology Inc., Waltham, MA, USA)로 정량분석 후, 동일량의 단백질을 10% SDS-acrylamide gel로 전기영동하고, PVDF membrane (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 이동시킨 후 5% non-fat dry milk로 상온에서 1시간 동안 blocking 하였다. 1시간 후, 1차 항체를 5% non-fat dry milk에 용해시켜 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 membrane을 0.05% tween-20이 포함된 tris-buffered saline (TBS-T)로 5분간 3회 세척하였다. 그 후 2차 항체는 5% non-fat dry milk에 용해시켜 membrane에 상온에서 1시간 처리하였고, TBS-T로 5분간 3회 세척 후 membrane은 ECL western blotting substrate (Amersham Biosciences Co., Little Chalfont, England)를 이용하여 단백질을 확인하였다.

Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)

세포에서 RNA를 추출하기 위해서 세포를 4℃에서 유지된 1 × PBS로 2회 세척한 후, RNeasy Mini kit (QIAGEN GmbH., Hilden, Germany)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 1 ㎍의 total RNA를 Verso cDNA synthesis kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR은 PCR Master Mix Kit (Promega Co., Madison, WI, USA)를 이용하여 수행되었고, 사용된 primer는 Table 1과 같다. RT-PCR은 30회 사이클로 진행되었으며, 각 사이클은 94℃에서 30초간의 denaturation, 55℃에서 1분간의 annealing, 72℃에서 1분간의 extension으로 구성되었다. PCR 후 증폭된 산물은 1% 아가로스 겔에서 100 V로 15분 동안 전기 영동하였다.

Table 1.

Sequence of oligonucleotide primers used for RT-PCR.

Gene Name Sequences
Tyrosinae ・Forward 5’-GACGGTCACTGCACACTTTG-3’
・Reverse 5’-GCCATGACCAGGATGAC-3’
GAPDH ・Forward 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’
・Reverse 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’

통계분석

모든 결과는 3회 반복 측정 후 평균± 표준편차로 나타내었고, 처리간 유의성은 Student’s t-test로 검증하여 p-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다(Microsoft Exel 2010, Microsoft, Redmond, WA, USA).

결과 및 고찰

N. debneyi 지상부의 에탄올 농도별 추출물의 melanin 생성 억제활성

생물체에 널리 분포되어 있는 melanin은 eumelanin과 pheomelanin으로 나뉜다(Yoo and Lee, 2021). 흑갈색을 띠는 eumelanin과 적황색을 띠는 pheomelanin의 종류와 특성에 따라 인간의 피부색, 머리카락색 그리고 눈동자 색이 결정되고, 자외선으로부터 인체를 보호하는 역할을 한다고 알려져 있다(Ando et al., 2012). 그러나 melanin이 과도하게 생성될 경우 질병이 유발되기도 한다고 알려져 있다(Ando et al., 2012). 본 연구에서는 N. debneyi 지상부의 최적 추출조건을 확립하기 위해, N. debneyi 지상부를 에탄올 농도별로 추출하고 그 추출물의 extracellular melanin과 intracellular melanin 생성 억제활성을 비교분석하였다. 그 결과, IBMX만 처리된 세포에서는 무처리구와 비교했을 때, extracellular melanin과 intracellular melanin의 생성이 과도하게 유도되었지만, N. debneyi 지상부의 에탄올 추출물은 IBMX 매개 extracellular melanin과 intracellular melanin의 생성을 유의적으로 감소시켰다(Fig. 1A and 1B). N. debneyi 지상부의 에탄올 추출은 에탄올 농도가 높아질수록 IBMX 매개 extracellular melanin과 intracellular melanin의 생성 억제활성도 높아지는 것으로 나타났다(Fig. 1A and 1B). 이는 N. debneyi 지상부의 에탄올 추출 시 에탄올 농도가 높아질수록 N. debneyi 지상부 내의 유효 성분이 더 효과적으로 추출되었기 때문이라고 판단된다. 특히, 50% (ND50E)와 70% (ND70E)의 에탄올은 melanin 생성을 억제하는 유효성분의 농도를 높여 주어 이러한 억제 효과를 극대화하는 것으로 판단된다. 이러한 결과는 N. debneyi 지상부를 미백 화장품 소재 개발 시 N. debneyi 지상부를 50% 에탄올로 추출하는 것이 가장 적정하다는 것을 시사할 수 있다. 그러나 추가 연구를 통해 N. debneyi 지상부의 50% 에탄올 추출물 내 melanin 생성 억제활성 관련 유효성분의 분석이 필요하다고 판단된다.

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Fig. 1.

Comparative analysis of the inhibitory activity on extracellular and intracellular melanin production by ethanol extracts from N. debneyi aerial parts at different ethanol concentrations in B16F10 cells. B16F10 cells were pretreated with the sample (100 ㎍/mL) for 2 h and then co-treated with IBMX (100 μM) for 48 h.

N. debneyi 지상부의 50% 에탄올 추출물의 농도별 melanin 생성 억제활성

N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)의 농도별 melanin 생성 억제활성을 평가하기 위해 N. debneyi 지상부를 50% 에탄올 추출물(ND50E)을 2시간 전처리한 후 IBMX를 48시간 처리하였다. 그 후 extracellular melanin과 intracellular melanin을 측정한 결과, 50 ㎍/mL 농도의 N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)는 미약하게 IBMX 매개 extracellular melanin과 intracellular melanin의 생성을 억제하였지만 100 ㎍/mL 농도와 200 ㎍/mL 농도의 N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)은 주목할 만하게 IBMX 매개 extracellular melanin과 intracellular melanin의 생성을 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 2A and 2B). 그러나 N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)은 B16F10세포에 대한 세포독성은 없는 것으로 나타났다(Fig. 2C). 이 결과는 농도 의존적인 melanin 생성 억제 효과를 나타내며, N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)이 melanin 생성 억제제로서의 잠재력을 가질 수 있음을 시사한다. 특히, 100 ㎍/mL와 200 ㎍/mL 농도의 N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)는 IBMX 매개 melanin 생성을 현저히 억제하여 피부 미백이나 색소 침착과 관련된 질환의 치료제 개발에 중요한 기초자료가 될 수 있다.

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Fig. 2.

Effect of 50% ethanol extracts from N. debneyi aerial parts against extracellular and intracellular melanin production in B16F10 cells. (A and B) B16F10 cells were pretreated with the sample at the indicated concentrations for 2 h and then co-treated with IBMX (100 μM) for 48 h. (C) B16F10 cells were treated with the sample at the indicated concentrations for 48 h. Cell viability was measured using MTT assay.

N. debneyi 지상부의 50% 에탄올 추출물의 tyrosinase 발현 억제 활성

Tyrosinase는 melanin 생성과정에 관여하는 효소로써 tyrosine을 기질로 하여 DOPA로 전환시키며 나아가 DOPA quinone으로 산화시키는 등의 일련의 효소 반응을 통하여 melanin을 생성한다(Shin et al., 2017). 그리고 tyrosinase의 발현을 억제하는 것은 멜라닌 생성을 저해하기 위한 가장 효과적인 전략 중 하나로 여겨지고 있다(Pillaiyar et al., 2017). 이에 따라, 최근 tyrosinase를 표적으로 하는 다양한 억제제들이 활발히 개발되고 있습니다. 그리하여 N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)이 tyrosinase의 발현을 억제하는지 RT-PCR 분석과 Western blot 분석으로 확인하였다. 그 결과, N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)은 tyrosinase의 mRNA 발현에는 아무런 영향이 없었으나 tyrosinase의 단백질 수준은 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다(Fig. 3). 이는 N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)이 tyrosinase의 전사 단계에서는 영향을 미치지 않고 post-transcriptional 또는 translational 수준에서 tyrosinase 단백질의 발현을 조절할 수 있음을 의미한다. 즉, N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)은 tyrosinase 단백질의 안정성에 영향을 미치거나 단백질 분해 경로를 활성화하여 tyrosinase의 단백질 수준을 감소시킬 가능성이 있다. 이를 통해 N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)가 mRNA 발현에는 영향을 미치지 않으면서도 tyrosinase 단백질의 축적을 억제하는 새로운 기전을 가지고 있을 수 있음을 제시한다. Tyrosinase는 멜라닌 합성 과정의 핵심 효소로, 멜라닌 생성을 조절하는 중요한 역할을 한다(Pillaiyar et al., 2017). 따라서 tyrosinase의 단백질 수준을 감소시키는 N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)의 작용은 멜라닌 생성 억제제로서의 잠재력을 크게 높여준다. 이와 같은 기전은 멜라닌 과다 생성으로 인한 피부 질환, 예를 들어 기미나 주근깨 등의 치료에 유용하게 활용될 수 있다. 추가적으로, N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)가 tyrosinase 단백질 수준을 감소시키는 구체적인 기전을 밝히기 위해서는 단백질 분해 경로, 예를들어 ubiquitin-proteasome system이나 autophagy와 같은 경로에 대한 추가 연구가 필요하다. 이러한 연구를 통해 N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)의 정확한 작용 메커니즘을 규명하고, 이를 기반으로 한 효과적인 멜라닌 생성억제제를 개발할 수 있을 것이다.

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Fig. 3.

Effect of 50% ethanol extracts from N. debneyi aerial parts against tyrosinase expression in B16F10 cells. B16F10 cells were pretreated with the sample at the indicated concentrations for 2 h and then co-treated with IBMX (100 μM) for 48 h. The mRNA level and protein level of tyrosinase were measured using RT-PCR and Western blot analysis, respectively.

적 요

본 연구에서는 N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)의 미백화장품 소재로의 활용가능성을 파악하기 위해 N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)의 melanin 생성억제활성을 평가하였다. N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)은 tyrosinase의 단백질 수준을 감소시켜 extracellular melanin과 intracellar melanin의 생성을 억제하는 것으로 판단된다. N. debneyi 지상부 50% 에탄올 추출물(ND50E)은 효과적인 멜라닌 생성 억제제로서 미백화장품 소재로의 활용 가능성이 높음을 제안한다.

Acknowledgements

본 논문은 2023년 국립안동대학교 기본연구지원사업에 의해 이루어진 결과로 이에 감사드립니다.

Conflicts of Interest

The authors declare that they have no conflict of interest.

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